哺乳動(dòng)物細(xì)胞核移植研究進(jìn)展

王愛萍

（四川衛(wèi)生康復(fù)職業(yè)學(xué)院 基礎(chǔ)教研室，四川 自貢 643000）

哺乳動(dòng)物細(xì)胞核移植是指將發(fā)育不同時(shí)期胚胎細(xì)胞或成年動(dòng)物體細(xì)胞的細(xì)胞核，經(jīng)顯微操作，移植到成熟的去核卵母細(xì)胞中，組成重構(gòu)胚并使之發(fā)育成新動(dòng)物個(gè)體的技術(shù)。細(xì)胞核移植是動(dòng)物克隆的主要途徑，所以又稱之為克隆技術(shù)。1997年體細(xì)胞克隆綿羊Dolly的誕生（Wilmut et al,1997）,是細(xì)胞核移植技術(shù)的一個(gè)重要的里程碑。它向全世界證明了高度分化的體細(xì)胞具有遺傳的全能性和發(fā)育的可逆性。在科學(xué)領(lǐng)域引發(fā)了克隆動(dòng)物研究的高潮。

1 核移植技術(shù)的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

細(xì)胞核移植技術(shù)是德國(guó)發(fā)育生物學(xué)家Spermann[1]于1938年為解決核質(zhì)相互關(guān)系問題提出把分化的細(xì)胞導(dǎo)入去核的卵母細(xì)胞中并觀察其胚胎發(fā)育情況的研究，同年他還提出將任何時(shí)期的細(xì)胞核注入去核卵母細(xì)胞內(nèi)然后通過觀察其發(fā)育能力就可以確定該時(shí)期細(xì)胞核的發(fā)育潛能的設(shè)想。但由于當(dāng)時(shí)核移植技術(shù)條件的限制，用分化的細(xì)胞未能獲得成功。直到20世紀(jì)50年代，才有兩棲類美洲豹蛙和非洲瓜蟾克隆的報(bào)道（Briggs和King,1952）。隨后Gurdon等用蟾蜍、蝌蚪的腸上皮細(xì)胞和體外短期培養(yǎng)的完全分化的體細(xì)胞進(jìn)行核移植分別獲得成體蟾蜍和蝌蚪，證實(shí)兩棲類已分化細(xì)胞的基因組具有結(jié)構(gòu)上的完整性和功能上的全能性。此后，人們轉(zhuǎn)向哺乳動(dòng)物細(xì)胞核移植研究。

哺乳動(dòng)物核移植研究的最初成果在1981年取得，Illmensee和Hoppe[2]用鼠內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞直接注入去核的合子后，培育出發(fā)育正常的3只小鼠。但這一試驗(yàn)未能被重復(fù)出來；1983年，McGrath和Solth首次利用顯微操作技術(shù)和細(xì)胞融合技術(shù)，以單細(xì)胞期的小鼠胚胎作為供核細(xì)胞進(jìn)行核移植，得到了核移植后代，并建立了重復(fù)性很高的核移植操作程序[3]；1994年，Collas和Barrnes將供核細(xì)胞通過卵母細(xì)胞內(nèi)直接注射的方法構(gòu)建了核移植重構(gòu)胚胎，并得到了犢牛[4]；這一時(shí)期許多研究者對(duì)胚胎干細(xì)胞和成年動(dòng)物體細(xì)胞的核移植試驗(yàn)也做了大膽嘗試，但進(jìn)展不大。1997年，在細(xì)胞核移植研究歷史上發(fā)生了一件具有轟動(dòng)效應(yīng)的事件，英國(guó)羅斯林研究所的研究人員首次利用成年母綿羊的乳房上皮細(xì)胞，通過細(xì)胞核移植技術(shù)得到了體細(xì)胞克隆羊——“Dolly”[5]，“Dolly”的出生以事實(shí)向人們證明，完全分化的體細(xì)胞不僅可以被逆轉(zhuǎn)，而且完全可以發(fā)育成一個(gè)新的個(gè)體。從此以后，全世界掀起了體細(xì)胞克隆的熱潮。1998年Wakayama等利用小鼠卵丘細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植研究獲得成功[6]；1999年Wells等用牛顆粒細(xì)胞進(jìn)行核移植也獲得了成功[7]。至2002年，Keefer等[9]人將91枚重構(gòu)胚移植到8只受體山羊體內(nèi)，50%受孕，生出7只小山羊，核移植效率明顯比以前提高。迄今為止，全世界已有乳腺細(xì)胞[5]、卵丘細(xì)胞和輸卵管上皮細(xì)胞[8]、顆粒細(xì)胞[7]、肌肉細(xì)胞[10]、皮膚細(xì)胞[11]、睪丸支持細(xì)胞[12]、胎兒成纖維細(xì)胞[9]和耳皮膚成纖維細(xì)胞[13]等9種體細(xì)胞克隆后代成功誕生。

我國(guó)的細(xì)胞核移植技術(shù)研究開始于20世紀(jì)60年代。1963年，著名試驗(yàn)胚胎學(xué)家童第周利用胚胎細(xì)胞克隆技術(shù)進(jìn)行魚類囊胚細(xì)胞核移植研究，在70年代獲得屬間和種間核移植魚。上個(gè)世紀(jì)九十年代起，國(guó)內(nèi)學(xué)者開始進(jìn)行哺乳動(dòng)物克隆研究。1991年，張涌等[14]利用4～32細(xì)胞的胚胎克隆了5只山羊。2000年，楊向中領(lǐng)導(dǎo)的科研小組，用一頭17歲高齡奶牛耳皮膚細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植研究，獲得了6頭體細(xì)胞克隆牛[15]。標(biāo)志著中國(guó)已完全掌握了世界一流的體細(xì)胞克隆牛技術(shù)，從1997年到現(xiàn)在短短幾年的時(shí)間里，在體細(xì)胞核移植領(lǐng)域里，人們相繼在牛、山羊、豬、貓和兔等多種動(dòng)物上取得了成功。

2 目前核移植技術(shù)中存在的問題

2.1 體細(xì)胞克隆成功率低

同體外授精相比，效率低是目前核移植技術(shù)應(yīng)用發(fā)展中普遍存在的現(xiàn)象。主要表現(xiàn)在:囊胚發(fā)育率不穩(wěn)定，移植后受胎率低，出現(xiàn)畸胎、死胎、流產(chǎn)以及出生后早亡率高，造成效率低。但不同的學(xué)者對(duì)此產(chǎn)生的意見卻不一，有人認(rèn)為是培養(yǎng)條件未達(dá)到最佳化，也有人認(rèn)為是細(xì)胞的問題，現(xiàn)有資料表明，即使應(yīng)用體內(nèi)培養(yǎng)的方法成活率也不過10%,看來試圖通過改進(jìn)培養(yǎng)體系來提高核移植效率還無從著手。因此，要更深入地研究核質(zhì)間的互作機(jī)理，以便使核移植技術(shù)得到進(jìn)一步改善。

2.2 供體核與受體胞質(zhì)細(xì)胞周期同步的問題

第一次體細(xì)胞核移植獲得成功的重要因素之一就是對(duì)細(xì)胞周期同步化的認(rèn)識(shí)，而且研究人員也首次認(rèn)識(shí)到應(yīng)用G0期細(xì)胞的必要性。目前體細(xì)胞核移植中常用的方法就是將處理后的供體細(xì)胞核移入到去核的MII期卵母細(xì)胞中，迄今為止，幾例成功的豬體細(xì)胞核移植研究中，都采用了去核的成熟MII期卵母細(xì)胞作為核受體。大多數(shù)研究者認(rèn)為用成熟的去核MII期卵母細(xì)胞作為核受體，有利于啟動(dòng)已分化的供體核在重構(gòu)胚中的再程序化，保證一定的核移植成功率。當(dāng)用去核的MII期卵母細(xì)胞作為受體細(xì)胞時(shí)，必須使供體細(xì)胞與受體細(xì)胞的細(xì)胞周期同步化，這樣有助于重組胚胎的發(fā)育。 在卵母細(xì)胞激活后，MPF活性下降、染色質(zhì)去凝集，在核膜重建的過程中 DNA復(fù)制，染色體加倍，因而核移植時(shí)供體細(xì)胞周期的選擇對(duì)于第一次細(xì)胞分裂末期，染色體二倍體的保持是很重要的。

2.3 體細(xì)胞基因突變和其他遺傳問題

研究證明，基因突變與DNA復(fù)制次數(shù)有著密切的關(guān)系，分裂次數(shù)越多的體細(xì)胞，發(fā)生突變的可能性越大。對(duì)于核移植材料來源方面，這是不可避免的問題。如果把動(dòng)物的基因組弄清楚，并能對(duì)體細(xì)胞的突變基因加以修復(fù)的話，核移植的效率一定能夠得到大大的提高。

3 哺乳動(dòng)物核移植技術(shù)的應(yīng)用前景

3.1 擴(kuò)大優(yōu)良育種群和拯救瀕危動(dòng)物

采用核移植技術(shù)可加速育種的過程，在短時(shí)間內(nèi)有效地?cái)U(kuò)大種群的數(shù)量，保持種群的性狀，避免了自然交配所帶來的優(yōu)良性狀的分離和減弱。將核移植與基因打靶相結(jié)合，可以對(duì)物種的基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾，產(chǎn)生具有優(yōu)良性狀的新品種。用家畜的體細(xì)胞進(jìn)行基因打靶可將我們感興趣的目的基因插入到特定的位置，把篩選出的陽性克隆作為核供體進(jìn)行核移植，這樣便可獲得組織特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

3.2 體細(xì)胞克隆技術(shù)在醫(yī)藥生產(chǎn)方面的價(jià)值

將體細(xì)胞克隆技術(shù)與生物反應(yīng)器的生產(chǎn)制作技術(shù)結(jié)合可以對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)基因或基因組修飾后，制作生產(chǎn)生物反應(yīng)器 利用動(dòng)物的乳腺、膀胱等器官，生產(chǎn)治療人類疾病、保健所需的蛋白。許多全球知名的生物技術(shù)企業(yè)尤其看重體細(xì)胞克隆技術(shù)在這些方面的應(yīng)用價(jià)值，紛紛投資科研機(jī)構(gòu)開展研究，實(shí)際上第一個(gè)體細(xì)胞克隆動(dòng)物綿羊Dolly的誕生就是這種動(dòng)機(jī)的直接產(chǎn)物。

3.3 在臨床方面的作用

通過深入研究細(xì)胞核質(zhì)的相互作用 控制胚胎細(xì)胞的分化方向，有望獲得適合向人體移植的具有遺傳改變的動(dòng)物器官。通過細(xì)胞核移植技術(shù)可以避免不必要的免疫排斥作用。目前，人們已經(jīng)利用體細(xì)胞克隆技術(shù)獲得了小鼠-小鼠、人-兔、人-人 ES細(xì)胞系，并已經(jīng)在小鼠模式上開展了如帕金森氏癥等神經(jīng)退行性疾病的治療嘗試。

4 結(jié)語

盡管目前來看，哺乳動(dòng)物核移植仍然面臨很多問題，哺乳動(dòng)物核移植技術(shù)自身仍在不斷完善中但相信隨著分子遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等相關(guān)基礎(chǔ)學(xué)科的進(jìn)一步發(fā)展，哺乳動(dòng)物核移植將在未來的生物學(xué)及人體器官移植等方面扮演著重要的角色。

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