黃豪達(dá) 綜述，趙 健 審校

(廣州醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院肺腫瘤科，廣東廣州 510019）

RNAi與順鉑腫瘤耐藥研究進(jìn)展

黃豪達(dá) 綜述，趙 健 審校

(廣州醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院肺腫瘤科，廣東廣州 510019）

RNAi;順鉑;耐藥;腫瘤

順鉑是一種以二價(jià)鉑與2個(gè)氯原子和2個(gè)氨分子結(jié)合的重金屬絡(luò)合物，自1978年第1次由FDA批準(zhǔn)用于治療睪丸癌和膀胱癌以來(lái)，已經(jīng)應(yīng)用于許多實(shí)體腫瘤的治療，但腫瘤對(duì)順鉑耐藥性的產(chǎn)生嚴(yán)重影響了其療效［1］。雖然目前已經(jīng)研發(fā)出了第3代的鉑類(lèi)藥物，但順鉑仍然是鉑類(lèi)藥物中應(yīng)用最廣、最有效的抗腫瘤藥物。因此探討腫瘤對(duì)順鉑耐藥機(jī)制是克服耐藥，提高療效的關(guān)鍵。近年來(lái)RNA干擾技術(shù)(RNA interference，RNAi）已應(yīng)用于表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究［2］，利用RNAi研究順鉑耐藥的分子機(jī)制及探討逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞順鉑耐藥的方法也隨之成為研究的熱點(diǎn)，本文作者對(duì)RNAi與腫瘤順鉑耐藥的最新研究進(jìn)行綜述。

1 RNAi的作用原理

RNAi是同源性雙鏈RNA誘發(fā)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，其可以通過(guò)與靶mRNA特異性結(jié)合，從而使mRNA發(fā)生降解而抑制相應(yīng)蛋白的表達(dá)。在起始階段，雙鏈RNA通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，隨后被細(xì)胞質(zhì)中的Dicer酶的Ⅲ型核糖核酸酶切割成21～23個(gè)堿基;3’端帶有2～3核苷酸末端突出的雙鏈RNA分子，這種小的雙鏈RNA分子被稱為小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA）［3－4］。siRNA 同Argonaute 2等一些蛋白酶結(jié)合形成大約500 000個(gè)bp的復(fù)合物，稱為RNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA－induced silencing complex，RISC），從功能上分析 RISC應(yīng)包括解旋酶和1個(gè)核酸內(nèi)切酶Slicer。解旋酶在ATP供能情況下將siRNA的雙鏈解開(kāi)，正義鏈從RISC中釋放出來(lái)，此時(shí)，RISC處于激活狀態(tài)［5］?；罨腞ISC通過(guò)堿基配對(duì)與靶mRNA結(jié)合，而后mRNA分子斷裂，斷裂的mRNA分子在核糖核酸酶的作用下被降解。新產(chǎn)生的siRNA片斷可再次形成RISC，繼續(xù)降解mRNA，從而產(chǎn)生高效抑制基因表達(dá)的效果。

2 順鉑的抗腫瘤作用及耐藥機(jī)制

2.1 順鉑的抗腫瘤作用 順鉑本身是一種中性的、正方形Pt(CN）配合物，含有2個(gè)氯離子配體位于順位，這種結(jié)構(gòu)在血漿中及細(xì)胞外具有穩(wěn)定性。當(dāng)順鉑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，由于細(xì)胞內(nèi)高濃度的氯離子，會(huì)產(chǎn)生一系列的效應(yīng)，使順位的氯離子自發(fā)地為水分子所替代，形成具有親水性的正電子化合物，并易于與許多細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)相結(jié)合，特別是內(nèi)生的親核物質(zhì)，如谷胱甘肽、蛋氨酸、金屬硫蛋白等形成蛋白質(zhì)、DNA、RNA等的加合物［6］。水合的順鉑易于與鳥(niǎo)嘌呤堿基上的N7上的N結(jié)合，也可與胞嘧啶及腺嘌呤結(jié)合，引起DNA鏈間或鏈內(nèi)交聯(lián)，形成將近 65% 的 1，2—d(GpG），25% 的 1，2—d(ApG），5% ～10%的 1，3—d(GpNpG）的鏈內(nèi)交聯(lián)，還有很少一部分形成鏈間交聯(lián)和單功能加合物［7］。隨著對(duì)順鉑作用機(jī)制研究的深入，人們發(fā)現(xiàn):1）只有少于1%的細(xì)胞內(nèi)順鉑會(huì)與核DNA結(jié)合［8］;2）在無(wú)細(xì)胞核細(xì)胞中，順鉑也產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒效應(yīng)［9］。由此推測(cè)，順鉑的抗腫瘤效應(yīng)可能是通過(guò)DNA損傷和線粒體的凋亡來(lái)共同實(shí)現(xiàn)的。

2.2 順鉑的耐藥機(jī)制 順鉑通過(guò)復(fù)雜的分子機(jī)制發(fā)揮其抗腫瘤的作用，主要包括DNA損傷及線粒體的凋亡。但是順鉑耐藥最終導(dǎo)致全身化療的失敗，細(xì)胞對(duì)順鉑的解毒作用可能發(fā)生在幾個(gè)階段:1）順鉑與DNA結(jié)合之前(靶點(diǎn)結(jié)合前階段）;2）出現(xiàn)DNA加合物時(shí)(靶點(diǎn)結(jié)合中階段）;3）順鉑與DNA結(jié)合后發(fā)揮致凋亡作用時(shí)(靶點(diǎn)結(jié)合后階段）;4）與順鉑致細(xì)胞凋亡作用無(wú)直接關(guān)聯(lián)的分子信號(hào)通路(非靶點(diǎn)作用階段）。細(xì)胞對(duì)順鉑的解毒可能是一個(gè)或同時(shí)有數(shù)個(gè)因素在發(fā)揮作用，以致腫瘤細(xì)胞逃逸順鉑的殺傷作用。

3 RNAi與順鉑腫瘤耐藥的研究

3.1 RNAi與靶點(diǎn)結(jié)合前階段的研究 細(xì)胞在順鉑與DNA結(jié)合前對(duì)順鉑的解毒作用，主要是降低細(xì)胞內(nèi)順鉑的藥物濃度。銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(copper transporter 1，CTR1）是一個(gè)維持細(xì)胞銅代謝平衡的跨膜蛋白，研究［10］發(fā)現(xiàn)CTR1在維持細(xì)胞內(nèi)順鉑的濃度也具有重要作用，CTR1是研究酵母菌的時(shí)候被發(fā)現(xiàn)的，在敲除酵母菌CTR1基因后，酵母菌對(duì)順鉑的耐藥性增加，并且是由于藥物積聚濃度減少所導(dǎo)致的［11］。近來(lái)，CTR2也被發(fā)現(xiàn)與順鉑的耐藥具有密切的關(guān)系，Blair等［12］利用慢病毒載體敲除了具有CTR1+和CTR1－的一對(duì)鼠親本胚胎纖維原細(xì)胞的CTR2基因，發(fā)現(xiàn)在敲除CTR2基因后，順鉑對(duì)2種細(xì)胞的細(xì)胞毒性增加，細(xì)胞內(nèi)順鉑的濃度也增加，證明了CTR2具有與CTR1相反的功能，即CTR2能將細(xì)胞內(nèi)順鉑泵出細(xì)胞外，從而減弱順鉑的細(xì)胞毒性。ATP7A、ATP7B也屬于CTR家族成員，與CTR1共同維持細(xì)胞內(nèi)銅離子的平衡，其也參與了順鉑的耐藥［13］。Li等［14］利用 RNAi技術(shù)敲除了人肺癌細(xì)胞A549的順鉑耐藥細(xì)胞株的ATP7A基因，能夠部分逆轉(zhuǎn) A549對(duì)順鉑的耐藥，證明針對(duì)ATP7A基因的治療，可作為逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的一個(gè)方案。ATP結(jié)合盒式蛋白是一類(lèi)ATP驅(qū)動(dòng)泵，通過(guò)將順鉑泵出細(xì)胞外而介導(dǎo)順鉑的耐藥［15］，其中MRP2可能是該家族中介導(dǎo)順鉑外流從而導(dǎo)致順鉑耐藥的主要成員，MRP2的表達(dá)水平可能可用于預(yù)測(cè)腫瘤患者對(duì)順鉑的療效［16－17］。Materna 等［18］則首次利用 RNAi技術(shù)設(shè)計(jì)靶向MRP2的siRNA，敲除人卵巢腫瘤耐順鉑細(xì)胞A2780 RCIS的MRP2基因，成功證明MRP2基因敲除后A2780 RCIS細(xì)胞重新獲得對(duì)順鉑的敏感性。

3.2 RNAi與靶點(diǎn)結(jié)合中階段的研究 順鉑的抗腫瘤效應(yīng)很大程度是通過(guò)形成DNA鏈間或鏈內(nèi)交聯(lián)或形成DNA與蛋白質(zhì)的交聯(lián)，抑制DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致DNA斷裂或誤碼，從而抑制細(xì)胞有絲分裂。而在順鉑耐藥腫瘤細(xì)胞，由于核苷酸切除修復(fù)［19］及跨損傷修復(fù)［20］等的參與，使得順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA及RNA的攻擊失效。在核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)中，尤為重要的一個(gè)基因－人切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(human excision repair cross－complementing gene 1，ERCC1），已經(jīng)有許多證據(jù)證明，ERCC1與腫瘤患者的預(yù)后及對(duì)順鉑的治療效果相關(guān)［21－22］，在細(xì)胞水平也已經(jīng)證明在敲除ERCC1的細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性增加［23］。另一參與核苷酸切除修復(fù)的蛋白著色性干皮病基因互補(bǔ)組A(XPA），XPA參與早期DNA損傷的識(shí)別，XPA的谷氨酸殘基的延伸對(duì)接和ERCC1是必須的，XPA－ERCC1復(fù)合體能在受損部位的5’端切斷DNA單鏈，從而在核苷酸切除修復(fù)中發(fā)揮重要的作用，Arora等［24］設(shè)計(jì)靶向XPA－ERCC1的 siRNA，證明敲除 XPA－ERCC1后能夠減少腫瘤細(xì)胞DNA的損傷修復(fù)并逆轉(zhuǎn)順鉑的耐藥?？鐡p傷修復(fù)是指當(dāng)DNA鏈在復(fù)制過(guò)程中遇到損傷而使復(fù)制停頓時(shí)，機(jī)體啟動(dòng)跨損傷修復(fù)系統(tǒng)以忽略存在的損傷，繼續(xù)進(jìn)行DNA復(fù)制，然而付出的代價(jià)則是因此而產(chǎn)生的突變。REV3L定位于染色體6q21，是人基因組中與釀酒酵母菌Rev3同源的基因，其能與REV7共同構(gòu)成參與易誤性跨損傷修復(fù)的一個(gè)主要聚合酶 polζ，Wang等［25］的研究發(fā)現(xiàn)，在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，順鉑能誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的REV3LmRNA水平的升高，高表達(dá)細(xì)胞的REV3L能增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥，利用RNAi技術(shù)敲除REV3L，則能增加細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，表明REV3L可能在順鉑耐藥中扮演相當(dāng)重要的角色。Polζ在執(zhí)行跨損傷修復(fù)的功能時(shí)，需要有REV1的參與才能完成，REV1具有cDMP轉(zhuǎn)移酶活性，通過(guò)在新生鏈上無(wú)堿基位置插入cDMP來(lái)啟動(dòng)polζ的跨損傷修復(fù)。Okuda等［26］設(shè)計(jì)靶向 REV1的shRNA敲除卵巢癌細(xì)胞株2008的REV1基因，敲除后的卵巢癌細(xì)胞2008－shREV1－3.3比其親本細(xì)胞株對(duì)順鉑的敏感性高出1.5倍。與Wang等［25］的研究結(jié)果類(lèi)似，順鉑也誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞株2008的REV1蛋白表達(dá)增高，這也說(shuō)明了跨損傷修復(fù)在腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥中發(fā)揮著重要的作用。

3.3 RNAi與靶點(diǎn)結(jié)合后階段的研究 細(xì)胞自我凋亡信號(hào)通路的缺失使腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑發(fā)生耐藥。當(dāng)機(jī)體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)發(fā)生不可逆的損傷時(shí)，通常在細(xì)胞內(nèi)會(huì)有一些類(lèi)似“檢查站”的蛋白來(lái)發(fā)現(xiàn)這些損傷，并誘導(dǎo)細(xì)胞的自我凋亡，從而避免錯(cuò)誤的復(fù)制。P53就是一個(gè)執(zhí)行這種自我凋亡功能的重要基因。有P53缺陷的細(xì)胞不能執(zhí)行自我凋亡程序，甚至能在不利的條件下繼續(xù)分裂。但是，在一些野生型P53的腫瘤中，則有其他的因素改變阻斷了P53的功能，以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，例如MDM2基因的擴(kuò)增或MDM2蛋白的過(guò)表達(dá)［27］。MDM2在體內(nèi)最重要的功能是抑制野生型P53的激活轉(zhuǎn)錄功能和抗腫瘤活性，其與P53結(jié)合使后者泛素化后被蛋白酶體降解并清除［27］。在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌組織中都發(fā)現(xiàn) MDM2的擴(kuò)增［28－29］。Yu 等［30］敲除結(jié)腸癌細(xì)胞 LoVo的 MDM2 基因后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的凋亡增加，而且對(duì)順鉑的敏感性也增強(qiáng)，提示MDM2的擴(kuò)增可能與順鉑的耐藥有密切的聯(lián)系。近來(lái)還發(fā)現(xiàn)另一個(gè)與MDM2關(guān)系密切的基因，也與致DNA損傷化療藥物的耐藥有關(guān)。NEDD8是一種類(lèi)泛素的修飾蛋白，其能夠調(diào)控MDM2的表達(dá)，從而激活P53的功能［31］，NEDP1則是NEDD8的特異性前體加工酶，能將NEDD8分子從底物上解離出來(lái)重新進(jìn)入類(lèi)泛素化循環(huán)［32］。Watson 等［33］的研究顯示，在乳腺癌細(xì)胞 MCF－7中，敲除 NEDP1基因后，能增加MCF－7對(duì)多西他賽的耐藥性，并且在具有野生型P53的HeLa細(xì)胞和腎癌786－0細(xì)胞中也有相似的結(jié)果。細(xì)胞凋亡信號(hào)通路上某個(gè)基因表達(dá)的改變，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞在靶點(diǎn)結(jié)合后階段對(duì)順鉑耐藥，Galetin－3就是一個(gè)具有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)功能的基因，其廣泛表達(dá)于正常組織和腫瘤組織中，并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等有關(guān)［34］。Wang 等［35］利用 RNAi技術(shù)證實(shí) Galetin－3參與前列腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥，在對(duì)化療藥物不敏感的 PC3細(xì)胞株中敲除 Galetin－3基因后，給予50 μmol·L－1順鉑時(shí) caspase－3、caspase－9 的激活均增加，線粒體溶解增加，細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的含量比對(duì)照組細(xì)胞高3.8倍，增加了PC3細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。此外，對(duì)于在細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用的基因，利用RNAi技術(shù)敲除后能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，例如 Bcl－2 、survivin 、XIAP 基因［36－38］。

3.4 RNAi與非靶點(diǎn)作用階段的研究 腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥，有時(shí)也可與順鉑致細(xì)胞凋亡信號(hào)通路無(wú)直接關(guān)聯(lián)，這種耐藥的機(jī)制既與基因的損傷修復(fù)無(wú)關(guān)，也與順鉑對(duì)DNA損傷后監(jiān)管缺失無(wú)關(guān)，這里總結(jié)為非靶點(diǎn)作用階段。Beclin1基因也稱BECN1基因，是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性基因，是編碼自噬體的主要基因，在維護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面起重要作用，并且是完整細(xì)胞器和大分子蛋白降解的主要途徑［39］。Beclin1 與多種化療藥物的耐藥有關(guān)［40－41］，如 5－Fu、依瑪替尼，也有報(bào)道認(rèn)為Beclin1是一個(gè)新的候選抑癌基因，75%卵巢癌、50%乳腺癌以及40%前列腺癌組織中存在 Beclin1 基因的缺失性突變［42］。Kang等［43］在人口腔鱗癌細(xì)胞株Hep－2中，利用RNAi技術(shù)探討B(tài)eclin1基因的功能，發(fā)現(xiàn)敲除Beclin1基因后可以增加Hep－2細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，進(jìn)一步的研究表明，Beclin1敲除后對(duì)順鉑的敏感性增加是通過(guò)激活 caspase－3和caspase－9實(shí)現(xiàn)的。熱休克蛋白27(heat shock protein 27，HSP27）和HSP70被認(rèn)為是致癌基因并且與腫瘤的化療耐藥有關(guān)［44］，在順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞中HSP27 高表達(dá)［45］。Zhang等［46］在鼠 L929 細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染人HSP27基因，在Hela細(xì)胞中敲除HSP27基因后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了人HSP27基因的鼠L929細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性降低，而敲除了HSP27基因的Hela細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性增加，ASK1/p38的激活增加、Akt激活減少?；钚匝跏亲匀唤缙毡榇嬖诘囊环N具有很高生物活性的氧分子，也是致細(xì)胞凋亡中最常見(jiàn)的生物活性因子，活性氧產(chǎn)生所致的氧化還原失衡是細(xì)胞凋亡發(fā)生的共同中心環(huán)節(jié)。順鉑能夠增加多種腫瘤細(xì)胞中活性氧的水平而致細(xì)胞凋亡［47］。Mirk基因與減少細(xì)胞內(nèi)活性氧水平而增加胰腺癌細(xì)胞的存活有關(guān)［48］。Mirk在正常組織中的表達(dá)量非常少，而在腫瘤組織中的表達(dá)量則明顯升高［49］。Hu等［50］發(fā)現(xiàn)敲除了 Mirk基因的卵巢癌SKOV3和TOV21G細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性增加，細(xì)胞中PARP和caspase－3表達(dá)水平增加，在敲除Mirk基因后的細(xì)胞中加入抗氧化劑－N－乙酰半胱氨酸，發(fā)現(xiàn)PARP和caspase－3水平有所下降，在給予順鉑治療、未敲除Mirk基因組，加入N－乙酰半胱氨酸也同樣能降低PARP和caspase－3的水平。Mirk并不是一個(gè)必須的基因，在敲除Mirk的小鼠沒(méi)有出現(xiàn)明顯的表型［51］，因此Mirk極有可能作為逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的一個(gè)治療靶點(diǎn)。

4 展望

順鉑作為許多實(shí)體腫瘤一線化療的基礎(chǔ)用藥，解決其耐藥問(wèn)題顯得尤為重要，近年來(lái)利用RNAi技術(shù)對(duì)順鉑耐藥的機(jī)制及逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的研究在不斷深入，應(yīng)用RNAi沉默某個(gè)基因逆轉(zhuǎn)順鉑的耐藥已經(jīng)取得新的進(jìn)展，但將RNAi技術(shù)應(yīng)用于臨床仍面臨許多的難題［52］。隨著新的RNAi技術(shù)的出現(xiàn)和越來(lái)越完善的轉(zhuǎn)運(yùn)載體的設(shè)計(jì)［53－54］，相信該技術(shù)最終可成為腫瘤治療的一種強(qiáng)有力的手段。

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R730.2;R730.53

A

1673－5412(2013）02－0181－05

黃豪達(dá)(1985－），男，碩士在讀，主要從事肺癌綜合治療方面的研究。E－mail:hhd_wong@163.com

趙健(1963－），男，博士，主任醫(yī)師，主要從事肺癌綜合治療方面的研究。E－mail:zj_hjh@163.com

2012－10－17）