賈麗

真菌是一種真核細(xì)胞型微生物。種類(lèi)繁多，有10萬(wàn)多種，多數(shù)對(duì)人類(lèi)有益無(wú)害。少數(shù)為單細(xì)胞，大多數(shù)為多細(xì)胞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)比較完整，有細(xì)胞壁與典型細(xì)胞核。真菌比細(xì)菌大幾倍甚至幾十倍，用普通光學(xué)顯微鏡的低倍或高倍鏡就能看見(jiàn)。真菌的繁殖方式通常分為有性繁殖和無(wú)性繁殖兩類(lèi)［1］。致病性真菌多是無(wú)性繁殖還有的真菌可通過(guò)菌絲體的斷裂片段產(chǎn)生新個(gè)體，實(shí)驗(yàn)室“轉(zhuǎn)管”接種正是利用這一特點(diǎn)來(lái)繁殖菌種的。

1 標(biāo)本的采集及運(yùn)送

不同真菌感染應(yīng)采用不同的臨床標(biāo)本。淺部真菌感染可以采集毛發(fā)、皮屑、指(趾)甲、痂等，標(biāo)本在分離前常先用75%的乙醇消毒。深部真菌感染的檢查可取痰、尿液、口腔或陰道分泌物、腦脊液、各種穿刺液和活檢組織等。采集標(biāo)本時(shí)應(yīng)注意無(wú)菌操作。采集標(biāo)本后應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢查，一般不超過(guò)1～2 h，以免標(biāo)本變質(zhì)污染。標(biāo)本須在用藥前采集，對(duì)已用藥者則需停藥一段時(shí)間后再采集標(biāo)本。所有用于真菌學(xué)檢驗(yàn)的標(biāo)本，均需用無(wú)菌容器送檢。應(yīng)在用藥前采取標(biāo)本。如已用藥，則應(yīng)停藥后再采取標(biāo)本。

2 方法

2.1 直接檢查法 直接鏡檢是最簡(jiǎn)單也是很有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。其優(yōu)點(diǎn)在于簡(jiǎn)便、快速，無(wú)菌部位的陽(yáng)性結(jié)果可直接確定真菌感染。但是，除了少數(shù)真菌外，多數(shù)不能確定其種類(lèi)。由于陽(yáng)性率較低，陰性結(jié)果亦不能排除診斷，有時(shí)需反復(fù)檢查或做其他方法檢查以進(jìn)一步確定。直接鏡檢對(duì)于淺表和皮下真菌感染最有幫助。不染色標(biāo)本檢查取皮屑、毛發(fā)、指(趾)甲屑等標(biāo)本置于載玻片中央，滴加100～200 g/L KOH溶液1～2滴，以蓋玻片覆蓋后在火焰上微微加熱，使組織或角質(zhì)溶解、透明后，先于低倍鏡檢查有無(wú)真菌菌絲或孢子，再以高倍鏡檢查其特征，可初步診斷真菌感染。

2.2 染色標(biāo)本檢查 有些真菌如深部真菌需要染色后才能更清楚地觀察，常用的染色方法有革蘭染色法所有真菌均為革蘭陽(yáng)性。乳酸酚棉藍(lán)染色法取標(biāo)本于載玻片上，滴加染液，加上蓋玻片后于鏡下觀察，真菌被染成藍(lán)色。該法適用于各種真菌的直接檢查，培養(yǎng)物涂片檢查及小培養(yǎng)標(biāo)本保存等。熒光染色法用0.1%吖啶橙對(duì)標(biāo)本涂片和組織切片進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察，白假絲酵母菌、皮炎芽生菌、球孢子菌為黃綠色，新型隱球菌、鼻孢子菌為紅色，組織胞漿菌為紅黃色，曲霉菌為綠色。

2.3 分離培養(yǎng)法 真菌培養(yǎng)是目前鑒定真菌的唯一方法。其培養(yǎng)方法有多種，根據(jù)需要選用最適合的方法。在不同的培養(yǎng)基上真菌菌落形態(tài)變化很大，一般以沙保弱(SDA)培養(yǎng)基為基準(zhǔn)描寫(xiě)菌落的形態(tài)。常用的培養(yǎng)基有無(wú)選擇性培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。平皿培養(yǎng)法是將培養(yǎng)基傾注于平皿，然后將皮屑、甲屑、毛發(fā)標(biāo)本經(jīng)70%乙醇浸泡2～3 min以殺死雜菌，無(wú)菌鹽水洗凈后接種于沙保弱培養(yǎng)基上，置25℃ ～28℃培養(yǎng)數(shù)日至數(shù)周，觀察菌落特征;其他標(biāo)本接種于血平板或沙保弱培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)。此法的優(yōu)點(diǎn)是便于分離并觀察菌落特征，但水分易蒸發(fā)。試管培養(yǎng)法為實(shí)驗(yàn)室中最常用的一種方法，一般用于菌種傳代接種與保存［2］。在大口徑試管中裝入培養(yǎng)基，制成斜面。接種方便、不易污染。小培養(yǎng)法是觀察真菌結(jié)構(gòu)特征及生長(zhǎng)發(fā)育全過(guò)程的有效方法。取無(wú)菌“V”形玻棒(或浸泡乙醇，干后)放入無(wú)菌平皿內(nèi);取無(wú)菌載玻片(或浸泡乙醇，干后)放在玻棒上;制備1 cm2馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)于載玻片上;在瓊脂塊的每一側(cè)用接種針接種待檢菌;⑤取灼燒后的蓋玻片蓋在瓊脂塊上，平皿內(nèi)放少許無(wú)菌蒸餾水，加蓋，置于25℃ ～28℃孵育(白假絲酵母菌培養(yǎng)24～48 h，而皮膚癬真菌培養(yǎng)1～7 d);⑥培養(yǎng)后，棄瓊脂塊于消毒液中，滴加乳酸酚棉藍(lán)染液于載玻片上，再將取下的蓋玻片置于載玻片上染色鏡檢。

3 討論

真菌是易發(fā)生變異的一類(lèi)微生物，在培養(yǎng)基上多次人工傳代或培養(yǎng)時(shí)間過(guò)久，其形態(tài)結(jié)構(gòu)、菌落性狀、色素甚至毒力都可發(fā)生改變。真菌對(duì)干燥、陽(yáng)光、紫外線(xiàn)及一般消毒劑有較強(qiáng)的抵抗力。但不耐熱，60℃加熱1 h菌絲和孢子均被殺死。對(duì)真菌致病性研究?jī)H限于少數(shù)幾種真菌。不同的真菌可通過(guò)下列五種形式致病:致病性真菌感染、條件致病性真菌感染、真菌超敏反應(yīng)性疾病、真菌性中毒癥、真菌毒素與腫瘤的關(guān)系。臨床表現(xiàn)，真菌形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)和病理學(xué)。最直接的方法是能證明真菌存在于組織中，或在滲出物中可分離培養(yǎng)。病理組織學(xué)的改變只有少數(shù)病變具有特征性。

［1］秦啟賢，秦立摸，章強(qiáng)強(qiáng).臨床真菌學(xué).上海:復(fù)旦大學(xué)出版社，2001.

［2］李春陽(yáng)，劉方，郭淑蘭，等.醫(yī)院內(nèi)真菌感染的調(diào)查分析臨床皮膚科雜志，2002，31(2):121-122.