高瑞金 劉 學 崔衛(wèi)波 譚海明 張碧成 陸倩倩 張雨梅

（揚州大學獸醫(yī)學院 江蘇 揚州 225009）

血管內皮細胞是鋪陳于血管內壁的一層多功能細胞，在血管通透性屏障、免疫防御及炎性反應中起著極其重要的作用[1]。大量研究顯示，血管內皮是許多心血管疾病或危險因子作用的重要靶器官，具有相當活躍的內分泌和代謝功能。血管內皮細胞具有多重的生物學特性，而大鼠是主要的實驗動物，因此建立大鼠血管內皮細胞的體外培養(yǎng)方法對于研究內皮細胞特性、對作用于血管的藥物及抗腫瘤藥物的研究具有重要意義。本試驗采用植塊法分離大鼠血管內皮細胞，通過條件培養(yǎng)以及CD31免疫組化和管形成鑒定，建立了大鼠主動脈血管內皮細胞的體外培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

Wistar大鼠，雄性，200g左右，揚州大學比較醫(yī)學中心提供。人重組VEGF165，美國Prospec公司；HGDMEM和胎牛血清(FBS)，美國Gibco公司；兔抗大鼠CD31抗體，美國Santa Cruz公司；羊抗兔FITC熒光抗體，瑞士Roche公司；Matrigel基質膠，美國BD公司；Trypsin、Pen/ Strep/ Amphotericin B、戊巴比妥鈉、肝素鈉，生物工程(上海)有限公司；羊抗兔即用型SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、Mayor，s蘇木素均為武漢博士德生物工程有限公司產品；EDTA、氯化鈉、氯化鉀和磷酸二氫鉀，天津科密歐化學試劑有限公司；多聚甲醛、甲醇、硫酸銅、碳酸氫鈉和Na2HPO4·12H2O，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠胸主動脈血管內皮細胞的分離與原代培養(yǎng)Wistar大鼠2%戊巴比妥鈉麻醉后，經75%乙醇浸泡消毒后固定在手術板上，在超凈工作臺中打開胸腹腔，分離胸主動脈。取出胸主動脈，用PBS沖洗3～4次后，放入另一個無菌培養(yǎng)皿中，用眼科鑷小心除去血管周圍結締組織及脂肪，縱行剖開血管，用眼科剪分割成2mm×2mm大小的血管塊，將血管塊內皮面向下貼于鋪有明膠的50ml培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置2h后，加入適量含20%FBS、4ng/mlVEGF165和100μg/ml肝素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)[2-4]，液體僅遮蓋主動脈即可。培養(yǎng)4d后，棄去主動脈植塊，2～3d換液1次。

1.2.2 傳代培養(yǎng) 原代細胞培養(yǎng)約12～14d，遷出生長的細胞覆蓋培養(yǎng)瓶面積的2/3以上時即可傳代[3]。棄去培養(yǎng)液，用PBS沖洗培養(yǎng)瓶后，加0.25%胰蛋白酶消化3～5min，見內皮細胞收縮變圓，立即加入等體積的含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，吸管輕輕吹打并混勻，移入10ml離心管中，1000r/min離心10min，棄上清，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液適量制成細胞懸液，分至2個50ml培養(yǎng)瓶中。根據內皮細胞貼壁時間快于成纖維細胞，因此傳代4h后換液以除去未貼壁雜細胞，以后隔天換液1次。

1.3 細胞鑒定

1.3.1 細胞形態(tài) 倒置顯微鏡下觀察不同代次的細胞形態(tài)，是否呈現(xiàn)內皮細胞典型的折光性強、“鋪路石”樣等特點[3, 5]。

1.3.2 CD31免疫細胞分析 取2代細胞，制成細胞懸液后分于放有蓋玻片的六孔板中，進行細胞爬片培養(yǎng)。待細胞融合至80%左右取出蓋玻片，PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗后滴加0.5%Triton-X100 10min；PBS清洗后加3%H2O220min，PBS再次清洗后加5%BSA封閉30min。滴加兔抗鼠CD31一抗4℃過夜，PBS代替一抗作陰性對照。第2天經PBS清洗后分別滴加羊抗兔二抗及羊抗兔FITC熒光二抗，進行DAB顯色和熒光細胞分析。

1.3.3 內皮細胞的管形成 96孔板中先加入50μl基質膠于37℃培養(yǎng)箱中30min，后每孔加入1×104個第2代細胞懸液100μl，使細胞在基質膠表面均勻散開，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2h后觀察細胞形成的管狀結構。

1.4 內皮細胞生長曲線

原代細胞及傳代培養(yǎng)的細胞，調節(jié)細胞密度至2×105個/ml。24孔板每孔中加入細胞懸液100μl，含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基900μl，于37℃、5%CO2培養(yǎng)。第2天開始，每天4孔連續(xù)計數6d，分別繪制2～6代細胞的生長曲線。

2 結果

2.1 內皮細胞分離及形態(tài)

主動脈塊培養(yǎng)4d時，可見動脈塊附近有原代內皮細胞遷出生長，細胞呈梭狀或多角。培養(yǎng)12～14d，遷出生長的細胞覆蓋培養(yǎng)瓶面積的2/3以上，可見血管內皮細胞的“鋪路石”樣特征，見圖1。

圖1 大鼠胸主動脈血管內皮細胞(×100)

2.2 CD31免疫細胞分析

CD31抗體免疫細胞化學（1）SABC顯色，可見胞漿中淡黃棕色陽性細胞[6]；（2）FITC熒光二抗分析，可見胞漿中綠色熒光強陽性細胞，見圖2。

圖2 大鼠胸主動脈血管內皮細胞CD31免疫化學(×200)

2.3 內皮細胞管形成

從大鼠胸主動脈分離的原代內皮細胞及傳代培養(yǎng)細胞，在Matrigel基質膠中培養(yǎng)2h后，均可見形成部分管狀結構；至培養(yǎng)6h可見形成完整的血管樣小管。

2.4 內皮細胞傳代培養(yǎng)生長曲線

大鼠胸主動脈血管內皮細胞進行了六代傳代培養(yǎng)，不同代次細胞形態(tài)上無變化，細胞生長曲線見圖4。細胞于分瓶后4天至對數生長期，在相同培養(yǎng)時間不同代次細胞數無明顯差異(P>0.05）。

圖3 大鼠胸主動脈血管內皮細胞管形成(×50)

圖4 內皮細胞生長曲線

3 討論

內皮細胞的獲取方法主要包括機械刮取法、酶消化法和植塊法[7]。大鼠主動脈管腔較細酶消化法操作難度較大，獲取內皮細胞數量較少，而機械刮取法獲得的內皮細胞摻雜較多的雜細胞，本研究采用植塊法獲取的內皮細胞數量多，通過培養(yǎng)基中添加VEGF細胞因子、肝素等物質可以促進內皮細胞生長為優(yōu)勢細胞，從而保證了內皮細胞的純度；而傳代過程中采用的差速消化法，內皮細胞脫壁時間早于成纖維細胞，在內皮細胞脫壁時成纖維細胞仍處于貼壁狀態(tài)，可以進一步除去雜細胞，獲得純度較高的內皮細胞。

血管內皮細胞的標記物有第Ⅷ因子、CD31、vWF、CD34、VEGFR和Weibel-Palade小體等[8-10]。CD31作為成熟內皮細胞表面分子標志物之一，近年來較多的被用于內皮細胞的的鑒定。本試驗采用CD31免疫SABC組化及免疫熒光抗體分析對內皮細胞進行鑒定，內皮細胞陽性率較高，管形成試驗也進一步驗證了分離培養(yǎng)的內皮細胞的特性。

[1]黃麗英. 血管內皮細胞的原代培養(yǎng)及CXCL16對其影響的研究[D].云南昆明: 昆明醫(yī)學院, 2003.

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[3]楊翠燕, 王金鳳, 張艷萍等. 大鼠胸主動脈血管內皮細胞的分離培養(yǎng)和純化鑒定[J]. 解放軍醫(yī)學雜志, 2010, 35(2): 195-196.

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