Ion Torrent PGMTM 平臺在兒童遺傳性疾病診斷中應(yīng)用初探

楊 琳 王慧君 吳柏林 黃國英 周文浩 郭曉紅

人類基因組計劃( HGP) 耗資30 億美元，用了約10 年，完成了人類個體全基因組測序工作。隨之而來的人類基因組單倍型圖計劃、個體基因組計劃，再到千元基因組計劃，基因組時代高調(diào)而來。傳統(tǒng)的Sanger 測序技術(shù)［1］已不能滿足大規(guī)模核酸測序的需求，第二代測序技術(shù)( Next generation sequencing，NGS) 最主要的特征是高通量，快速、低成本［2～4］。NGS 通過反復(fù)測序同一區(qū)域的DNA 片段，達到很高的靈敏度和準(zhǔn)確度，同時自動化程度高，能在很短的時間內(nèi)完成對上百億堿基的測序，為基因組分析提供了新的手段。

NGS 由于其技術(shù)操作、數(shù)據(jù)質(zhì)量和數(shù)據(jù)分析等方面的問題，尚未廣泛應(yīng)用于臨床檢測。本研究采用Ion Torrent PGMTM平臺，基于PCR 擴增的文庫構(gòu)建方法，選取在兒科臨床較為常見的單基因遺傳性疾病，對其致病基因同時進行直接Sanger 測序和NGS 檢測，對其結(jié)果進行比較分析，旨在對NGS 在臨床檢測中的應(yīng)用進行初步探索。

1 方法

1.1 對象 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院( 我院) 臨床診斷為肌營養(yǎng)不良癥( DMD，2 例) 、膽汁酸合成障礙(1 例) 和甲基丙二酸血癥(1 例) 的病例。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，患兒家屬簽署知情同意書。

1.2 NGS 方法

1.2.1 外周血DNA 提取 外周靜脈血經(jīng)EDTA 抗凝，使用全血試劑盒提取DNA( Qiagen Inc.，Germantown，MD) 。使用NanoDrop ND-1000 分光光度計檢測DNA 濃度及吸光度值，電泳檢測DNA 降解程度。

1.2.2 PCR 擴增 DMD 基因( NM_004006.2，13 993 bp)引物為美國波士頓兒童醫(yī)院吳柏林教授惠贈。HSD3B7 基因( NM _ 025193. 3，2 203 bp) 、AMACR 基 因( NM _001167595.1，2 603 bp) 和MUT 基因( NM_000255.3，3 886 bp) 采用Primer3( v. 0. 4. 0) 進行在線引物設(shè)計。使用KAPA2G Robust HotStart ReadMix 進行擴增反應(yīng)。最終反應(yīng)體系為25 μL，其中DNA 模板20 ng，正反向引物各1.0 μL( 濃 度 為10 μmol·L-1) ，PCR Mix 12. 5μL。采 用Touchdown PCR，參數(shù)為95℃3 min，其后14 個循環(huán)為95℃20 s、64℃20 s( 每個循環(huán)降低0.5℃) 、72℃30 s，其后25個循環(huán)為95℃20 s、57℃20 s、72℃30 s，最終72℃延長5 min。5 μL PCR 產(chǎn)物進行2%瓊脂糖電泳，以判斷特異性擴增結(jié)果。

1.2. 3 PCR 產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)化 PCR 產(chǎn)物采用Sequal Prep Normalization kit ( catalog A10510-01；Invitrogen) 試劑盒進行標(biāo)準(zhǔn)化，其后將單個樣本的全部PCR 產(chǎn)物混合，標(biāo)準(zhǔn)化過程可以保證每個PCR 產(chǎn)物以等量混合。

1.2.4 Ion Torrent 文庫構(gòu)建 PCR 產(chǎn)物混合后，采用Ion Shear( catalog no.4471248；Life Technologies) 進行PCR 產(chǎn)物酶切打斷；采用Ion Xpress Plus Fragment Library Kit( catalog no.4471269； Life Technologies) 連接 街 頭； 采 用Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit ( catalog no. 4471250； Life Technologies) 分別加標(biāo)簽，標(biāo)簽1 ～4 分別對應(yīng)病例1 ～4。采用E-Gel 選擇大小在200 bp 的片段； 采用Ion Library Quantitation Kit( catalog no.4468802； Life Technologies) 進行qPCR 方法的文庫定量。

1. 2. 5 乳液PCR 和ISPs 富集 采用Ion template preparation kit ( catalog no. 4469000； Life Technologies) 和One Touch( Life Technologies) 進行乳液PCR( emulsion PCR，emPCR) ；采用Ion Xpress template kit、MyOne streptavidin C1 beads( catalog no. 4469001、650. 01； Life Technologies) 進行ISPs 富集。

1.2.6 Ion Torrent PGM 平臺的序列檢測 采用Ion PGM Sequencing kit( catalog no.4462923； Life Technologies) 及Ion Torrent 314 芯片( catalog no.4462923；Life Technologies) ，進行測序反應(yīng)。共65 個測序循環(huán)，使用18 歐姆純化水、標(biāo)準(zhǔn)壓縮氬氣驅(qū)動PGM 內(nèi)液體的流動。

1.2.7 結(jié)果分析 采用Ion torrent PGMTM服務(wù)器自帶分析軟件對測序結(jié)果初步分析，得到整體數(shù)據(jù)量、平均測序深度和參考序列匹配程度等數(shù)據(jù)。其后生成FASTA 文件，采用NextGENe 軟件( DEMO v2.3.0) 進行后續(xù)的序列數(shù)據(jù)結(jié)果分析，參考序列為NextGENe 軟件自帶的人類基因組序列( Human Genome 37.2) 。

1.2.8 MLPA 及Sanger 驗證結(jié)果 針對基因序列檢測，采用如前所述引物，使用KAPA2GTMRobust HotStart ReadMix進行擴增反應(yīng)，反應(yīng)體系及條件與前述相同。PCR 產(chǎn)物采用Applied Biosystems 3500xl 基因分析儀進行測序，結(jié)果采用MutationSurveyor( v 4.0.7 Demo) 進行數(shù)據(jù)分析。對于DMD 基因缺失/重復(fù)的檢測采用MRC Holland 公司商業(yè)化試劑盒( SALSA P034、P035) ，采用MLPA 技術(shù)進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 NGS 初步結(jié)果 如圖1 所示，芯片中有效區(qū)域達78.7%，其中連接有文庫的為96%。除去20%的多克隆，13%的低質(zhì)量文庫和12%測試片段，最終有效的文庫為67.1%，共578 830 個讀取片段。片段平均讀長為108 bp，最長讀長187 bp。產(chǎn)生的原始測序數(shù)據(jù)總量為62.8 Mb，其中達到Q20( 與參考序列99%匹配) 為54.99 Mb。選用了人類基因組( GRCh37，hg19) 上述基因的序列為參考序列( http: //www.ncbi. nlm. nih. gov/gene) 。結(jié)果發(fā)現(xiàn)總計有55.8 Mb 與參考序列匹配，占總序列數(shù)的90%。其中以DMD 基因參考序列編碼區(qū)比對的結(jié)果，平均測序深度為511.3 ×，AQ20 的平均測序深度為276.8 ×。

圖1 Ion Torrent PGMTM服務(wù)器產(chǎn)生的測序的初步分析結(jié)果Fig 1 Preliminary results of sequencing by Ion Torrent PGMTM

2.2 NGS 突變檢測結(jié)果( 表1) 例1: 檢測到DMD 基因編碼區(qū)一個已知致病突變: c.998C ＞A，p.333S ＞X； 4 個SNP ( http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/projects/SNP/) :rs228406( c.2645A ＞G，p.882D ＞G) ； rs1801187( c.5234G＞A，p. 1745R ＞H) ； rs1801188( c. 7728T ＞C，p. 2576N ＞N) ；rs1800280( c.8810G ＞A，p.2937R ＞Q) 。1 個意義不明變異:c.10127insT，F(xiàn)S。例2:檢測到DMD 基因5 個外顯子的缺失( g.2788933943-2790543577) ，為DMD 常見的致病缺失區(qū)段。例3:檢測到HSD3B7 基因編碼區(qū)2 個復(fù)合雜合突變:c.45-46delAG，F(xiàn)S； c.262G ＞G/C ，p. 88G ＞RG，第1個為已知致病突變位點，第2 個為未報道的位點。1 個SNP:rs9938550( c.748A ＞G，p. 250T ＞A) 。檢測到AMACR基因4 個SNP: rs3195676 ( c. 25G ＞GA，p. 9V ＞VM) ；rs10941112( c. 524G ＞GA，p. 175G ＞GD) ； rs2278008( c.829G ＞GA，p. 277E ＞EK) ； rs2287939( c. 602T ＞TC，p.201L ＞LS) 。例4: 檢測到MUT 基因編碼區(qū)1 個已知致病突變位點: c.728-729het-insTT，F(xiàn)S；3 個SNP: rs2229384( c.636G ＞G/A，p. 212K ＞K) ；rs8589( c.2011A ＞A/G，p. 671I＞V) ；rs1141321( c.1595C ＞CT，p. 532R ＞RH) 。1 個意義不明變異:c.1540G ＞GT，p.514Q ＞KQ。

2.3 MLPA 及Sanger 檢測結(jié)果 例1: 采用Sanger 測序方 法，檢測到DMD 基因編碼區(qū)5 個變異，分別為c.2645A ＞G、c.5234G ＞A、c.7728T ＞C、c.8810G ＞A、c.998C ＞A，均與Ion Torrent 測序結(jié)果相符合。Ion Torrent 檢測到的c.10127insT 改變，Sanger 測序未發(fā)現(xiàn)。例2: MLPA 驗證了Ion Torrent 檢測到的缺失。例3: HSD3B7 基因檢測到3 個變異: c.45-46delAG、c.262G ＞G/C、c.748A ＞G，均與Ion Torrent 測序結(jié)果相符合。AMACR 基因檢測到4 個SNP，分別為c.25G ＞GA、c.524G ＞GA、c.829G ＞GA、c.602T ＞TC，均與Ion Torrent PMG 測序結(jié)果相一致。例4:MUT 基因檢測到3 個變異:c.728-729het-insTT、c.636G ＞G/A、c.2011A＞A/G，與Ion Torrent 測序結(jié)果相符合。Ion Torrent 檢測到的c.1595C ＞CT、c.1540G ＞GT 改變，Sanger 測序未發(fā)現(xiàn)。

圖2 Ion Torrent PGMTM檢測結(jié)果Fig 2 Results of Ion Torrent PGMTM detection

3 討論

Ion Torrent PGMTM平臺的NGS 檢測，通過目的基因PCR 擴增、文庫構(gòu)建、乳液PCR 和測序流程，得到檢測結(jié)果僅需2 ～3 d。且以目的基因組合為基礎(chǔ)的后期數(shù)據(jù)處理，直觀和快捷。Ion 314 芯片為例，如本文獲得的總數(shù)據(jù)量為62.8 Mb，以DMD 基因為例，其編碼區(qū)及UTR 區(qū)域全長平均測序深度為200 倍計算，每張314 芯片可以同時完成4 ～5 個樣本的檢測，每例樣本的費用低于第一代Sanger 直接測序，與此同時，該技術(shù)所需投入的人力及耗時又有大幅度的降低，適合于臨床較大規(guī)模的檢測使用。

本文對4 例遺傳學(xué)疾病患兒的相對應(yīng)的4 個致病基因進行檢測。Ion Torrent PGMTM平臺共檢測到18 個變異，15個在Sanger 直接測序中也檢測到，即包括突變也包括SNP，即包含純合變異也包含雜合變異，突變類型中包含插入、缺失和置換，說明該檢測方法的敏感性較好。但Ion Torrent PGMTM平臺檢測到3 個假陽性，回顧原始圖像，發(fā)現(xiàn)1 個為在6 個連續(xù)的T 后面提示插入了一個T。此類問題是NGS數(shù)據(jù)處理、分析過程中遇到的較為共性的問題。從原理上講，Ion Torrent PGMTM平臺根據(jù)電壓變化的幅度來判斷連續(xù)相同堿基的個數(shù)方面仍存在一定的問題，這需要數(shù)據(jù)處理分析的不斷完善來加以避免。目前，已經(jīng)可以通過軟件對此類假陽性進行過濾。另外2 個假陽性發(fā)生在MUT 基因的檢測中，均提示為堿基置換，考慮可能為測序深度不足造成的結(jié)果不準(zhǔn)確，同時將部分G 和C 錯讀成了T，提示雜合變異，對于此類數(shù)據(jù)在今后臨床應(yīng)用中應(yīng)予以高度注意。這類假陽性可以通過提高測序覆蓋倍數(shù)進行鑒別。

本研究檢測的DMD 基因突變所導(dǎo)致的DMD，是人類常見的X 連鎖隱性遺傳性疾病，國外報道DMD 的發(fā)病率為1/ 3 917 ～1/4 700 活 產(chǎn) 男 嬰［5，6］。DMD 基 因 位 于Xp21.1-21.3，長度為2.4 Mb，是人類最大的基因之一。在DMD 基因突變類型中單一或多個外顯子的缺失占60% ～70%［7，8］，單一或多個外顯子的重復(fù)占5% ～10%［8～10］，序列改變( 點突變、小的插入或缺失、剪接異常) 在男性患者中占25% ～35%［8，11～13］。既往由于DMD 基因過大導(dǎo)致的直接測序時間、費用消耗巨大，許多實驗室也在尋找其他突變篩查方法，包括變性高效液相色譜分析、內(nèi)引物單一條件擴增技術(shù)［14，15］和高分辨率熔解曲線分析［16］，但隨著直接測序費用的降低，上述方法已少有使用。目前，多采用傳統(tǒng)PCR 及Sanger 直接測序方法，但其主要不足是人力及時間消耗大，效率低。針對于DMD 基因的微重復(fù)/微缺失的檢測，以往有多重PCR( mPCR)［17］、Southern 印跡［18］和FISH探針法。mPCR 只能覆蓋不足1/4 的外顯子；體系復(fù)雜，條件不易穩(wěn)定，優(yōu)化困難；通過用cDNA 探針的Southern 印跡需要1 ～2 周時間用來分析，使用放射性同位素作為示蹤物，并需要較多的DNA。近年來逐漸被發(fā)展起來的MLPA［19］和染色體微陣列芯片( CMA) 技術(shù)［20，21］所取代，但也受到成本、時間的限制，且不能同時針對序列改變進行檢測。而NGS 技術(shù)的誕生及發(fā)展，由于其高通量、高敏感性的優(yōu)點，針對于基因序列改變、男性X 連鎖的致病基因部分缺失的檢測，能彌補目前現(xiàn)有技術(shù)的不足，為臨床檢測提供新的方法。本文例1 為DMD 基因的點突變所導(dǎo)致，例2是DMD 基因5 個外顯子的缺失所導(dǎo)致，作為DMD 的兩種常見突變形式，都可被NGS 方法所檢測到。

HSD3B7 基因編碼3β 羥基δ5-C27 類固醇氧化還原酶，位于16p12-p11.2，含有6 個外顯子，DNA 全長3 kb，該基因的純合或復(fù)合雜合突變可引起先天性膽汁酸合成障礙1 型( CBAS1)［22］。AMACR 基因編碼α 甲基酰輔酶A 消旋酶，定位于5p13.2，含有6 個外顯子，該基因突變亦可引起先天性膽汁酸合成障礙4 型( CBAS4)［23］。本文例3，男，3 個月25 d，主因“皮膚黃染3 個月”就診，患兒生后4 d 出現(xiàn)黃染，大便呈黃色糊狀；體檢發(fā)現(xiàn)皮膚、鞏膜中度黃染，肝肋下捫及4 cm；血生化提示高結(jié)合膽紅素血癥、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶及總膽汁酸正常、轉(zhuǎn)氨酶升高、凝血功能障礙； 腹部B 超提示肝臟腫大，雙側(cè)腎臟損害，臨床診斷為先天性膽汁酸合成障礙繼發(fā)腎臟結(jié)晶。膽汁酸合成障礙占兒童膽汁淤積性疾病的1% ～2%，是一種罕見的遺傳性疾病，多為常染色體隱性遺傳。本例檢測到HSD3B7 基因c.45-46delAG 和c.262G ＞G/C 的復(fù)合雜合突變，其中c.45-46delAG 為已報道的致病突變［24］，c.262G ＞G/C 為未報道的錯義突變，導(dǎo)致第88 位氨基酸從甘氨酸變成精氨酸。結(jié)合對患兒父母的檢測結(jié)果，證實c.45-46delAG 來自患兒母親，c.262G ＞G/C來自患兒父親，診斷為CBAS1。

MUT 基因編碼甲基丙二酸輔酶A 異構(gòu)酶，該基因突變可引起甲基丙二酸血癥，MUT 位于6p12.3，含有13 個外顯子，DNA 全長35 kb［25］。本文例4，男，6 歲，主因“意識不清9 d 伴語言障礙”就診，尿串聯(lián)質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)甲基丙二酸，3-羥基丁酸和乙酰乙酸顯著升高，臨床診斷為甲基丙二酸血癥。NGS 檢測到c.729-730het-insTT，已有研究報道該位點的純合突變可導(dǎo)致酶活性的完全喪失［26］，但該患兒的遺傳方式以及雜合突變是否可導(dǎo)致酶活性的部分喪失，有待進一步對父母進行檢測及功能學(xué)的研究加以證實。

從本研究的檢測結(jié)果來看，Ion Torrent PGMTM在4 個基因中檢測到的15 個序列改變、1 個片斷缺失( 男性，X 染色體) ，與Sanger 直接測序結(jié)果完全一致，為NGS 技術(shù)應(yīng)用于臨床的可靠性提供了依據(jù)。但存在3 個假陽性報告，提示其數(shù)據(jù)處理、分析仍有待改進和完善。同時也強調(diào)了對于NGS 結(jié)果進行驗證的必要性。

綜上所述，二代測序Ion Torrent PGMTM平臺，采用PCR產(chǎn)物定量混合構(gòu)建文庫測序的方法，因其靈活可變、數(shù)據(jù)分析相對簡單的優(yōu)點，比較適用于臨床常見遺傳性疾病的檢測。但由于其技術(shù)本身可能帶來的假陽性問題，仍需要技術(shù)層面、數(shù)據(jù)分析層面的共同完善來加以避免。

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