管皖珍 楊小鳳 袁楊剛 蘇 敏 丁桂霞 黃松明 張愛華

人類HSP70 基因與TNF-α 基因均定位于6p21.3 區(qū)人類白細(xì)胞抗原( HLA) -Ⅲ類分子內(nèi)。研究表明HLA Ⅰ、Ⅱ類基因與過敏性紫癜( HSP) 發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性。目前研究發(fā)現(xiàn)HLA-Ⅲ類C4 基因的C4B* Q0 及C4A* Q0 基因頻率的增加與兒童HSP 患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)［1］。HSP70 基因主要包括HSP70-1、HSP70-2 和HSP-hom，其中HSP70-1 結(jié)構(gòu)性低水平表達(dá)，可以被熱誘導(dǎo)，HSP70-2 基因僅在誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)，而HSP70-hom 基因呈結(jié)構(gòu)性表達(dá)，HSP70-2 基因1267位點(diǎn)表現(xiàn)為G-A 多態(tài)性［2］。已有研究顯示HSP70-2 基因多態(tài)性與免疫性疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如強(qiáng)直性脊柱炎［3］、SLE［4］和糖尿?。?］等，但對于HSP 目前無相關(guān)研究。同時(shí)，TNF-α 啟動子區(qū)多態(tài)性也被證明與白塞氏病、SLE 等免疫性血管炎存在一定的相關(guān)性［6～8］。TNF-α -308 是目前研究的熱點(diǎn)位點(diǎn)，但其基因多態(tài)性在兒童HSP 的分布以及是否與腎臟受累有關(guān)尚無相關(guān)報(bào)道。本文觀察HSP70-2基因1267 位點(diǎn)及TNF-α 基因-308 位點(diǎn)多態(tài)性在HSP 患兒的分布，探討其與腎損害的關(guān)系。

1 方法

1.1 HSP 和紫癜性腎炎( HSPN) 診斷標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會腎臟病學(xué)組制定的HSPN 診斷與治療( 草案)［9］: 有確切的皮膚HSP 病史，伴或不伴腹部及關(guān)節(jié)癥狀；尿常規(guī)檢查正常；排除特發(fā)性血小板減少性紫癜、血栓性血小板減少性紫癜及其他血管炎疾病即可診斷HSP； 在HSP 病程中( 多數(shù)在6 個(gè)月內(nèi)) ，出現(xiàn)血尿和( 或) 蛋白尿即可確診HSPN。

1.2 HSP 組納入標(biāo)準(zhǔn) 同時(shí)滿足以下條件者被納入: ①2008 年9 月至2009 年5 月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院( 我院) 腎臟科住院治療的HSP 患兒； ②初發(fā)病例: 發(fā)病1 個(gè)月前無HSP 病史，發(fā)病1 個(gè)月內(nèi)因再次出現(xiàn)HSP 典型臨床表現(xiàn)收住我院者仍定義為初發(fā)；③完成6 個(gè)月的隨訪，明確HSPN 情況，進(jìn)一步分為腎損害亞組和非腎損害亞組。

1.3 HSP 組排除標(biāo)準(zhǔn) 具有以下任意一項(xiàng)者予以排除:①入院前已有明確腎臟受累或者非急性期的HSP 患兒；②患有其他腎臟疾病，如IgA 腎病、腎病綜合征、急慢性腎小球腎炎、遺傳學(xué)腎炎、腎臟腫瘤、腎臟外傷和腎臟畸形等；③患有其他免疫系統(tǒng)疾病，如SLE、自身免疫性肝炎、強(qiáng)直性脊柱炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕病等； ④除外其他可能為HSP70-2 或TNF-α 基因缺陷易感疾病，如慢性鼻竇炎、哮喘、慢性支氣管炎、纖維化性肺泡炎、糖尿病、慢性淋巴細(xì)胞白血病和神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等疾?。?0］；⑤發(fā)病前3 個(gè)月有應(yīng)用腎損害藥物史者；⑥不能提供明確病史或臨床資料者。

1.4 對照組 選取我院健康查體兒童( 無現(xiàn)癥感染，既往無HSP 病史、免疫性疾病史和家族史，體檢、尿常規(guī)、血生化及乙肝抗原均未見異常) ，或外科擇期手術(shù)患兒( 手術(shù)疾病與腎臟疾病和免疫性疾病無關(guān)) ，病例間無血緣關(guān)系。

1.4 隨訪 由專人對HSP 組患兒進(jìn)行電話隨訪，隨訪時(shí)間為6 個(gè)月，期間至少進(jìn)行3 次電話隨訪。隨訪內(nèi)容為詢問HSP 癥狀是否反復(fù)和尿液檢查結(jié)果。

1.5 HSP70-2 和TNF-α 基因多態(tài)性檢測

1.5.1 DNA 抽提 采集受試者靜脈血5 mL，應(yīng)用美國Promega 公司的試劑盒提取DNA，貯存于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 引物設(shè)計(jì) PCR 擴(kuò)增包含有HSP70-2 基因1267 位點(diǎn)G/A 和TNF-α 基因-308 位點(diǎn)G/A。應(yīng)用Primer 5.0 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，擴(kuò)增HSP70-2 基因的上游引物為5'-AAGGTGCAGAAGCTGCTGCA-3'， 下 游 引 物 為 5'-GGACTTGTCCCCCAT-3'； 擴(kuò) 增TNF-α 基因 的 上 游 引 物 為5'-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3'，下游引物為5'-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3'。引物由上海英維捷基生物技術(shù)有限公司合成。

1.5.3 PCR 反應(yīng) 20 μL PCR 反應(yīng)體系加入DNA 模板2 μL 。2 ×Tap PCR MasterMix 購自北京百泰克公司，反應(yīng)條件為94℃5 min，94℃40 s，59.0℃40 s，72℃40 s，72℃10 min，38 個(gè)循環(huán)。

1.5.4 酶切產(chǎn)物的檢測 20 μL 酶切體系包括15 μL PCR產(chǎn)物和10 U 限制性內(nèi)切酶NCO Ⅰ( 日本TAKARA 公司) ，37℃酶切16 h 過夜。酶切產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠( EB) 染色，凝膠成像系統(tǒng)下拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，HSP 組和對照組HSP70-2 基因型與Hardy-Weinberg 平衡的符合程度，各組間人群的基因型及等位基因頻率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 共納入HSP 患兒205 例，男121 例，女84例，年齡2 歲1 個(gè)月至14 歲7 個(gè)月，平均(8.2 ±2.7) 歲；其中非腎損害亞組121 例，男67 例，女54 例，腎損害亞組84例，男54 例，女30 例。對照組53 例，男33 例，女20 例，平均(8.0 ±2.5) 歲。HSP 組與對照組在性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＞0.05) 。

2.2 HSP 組與對照組HSP70-2、TNF-α 基因型和等位基因頻率比較 基因多態(tài)性PCR 檢測結(jié)果如圖1 所示。表1顯示，HSP70-2 基因1267 位點(diǎn)GG 基因型頻率HSP 組顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜0. 05) ； TNF-α 基因-308位點(diǎn)AA 基因型HSP 組顯著高于對照組( P ＜0.05) 。HSP 組和對照組HSP70-2 1267 位點(diǎn)A，G 等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＞0.05) ；TNF-α 基因-308 位點(diǎn)A 等位基因頻率HSP 組高于對照組( P ＜0.05) 。

2.3 非腎臟損害亞組和腎臟損害亞組HSP70-2、TNF-α 基因型和等位基因頻率比較 表1 顯示，兩亞組HSP70-2 基因1267 位點(diǎn)AA、AG、GG 基因型頻率和TNF-α 基因-308位點(diǎn)GG、GA、AA 基因型頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P 均＞0.05) ；兩亞組HSP70-2 基因A，G 等位基因頻率和TNF-α基因G，A 等位基因頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P 均＞0.05) 。

圖1 HSP70-2( +1267A/G) 、TNF-α( -308G/A) 基因PCR 結(jié)果Fig 1 PCR results of HSP70-2( +1267A/G) and TNF-α( -308G/A) genes

表1 HSP 組與對照組基因型和等位基因頻率比較［n( %) ］Tab 1 Comparison of frequency of genotypes between HSP group and control group［n( %) ］

3 討論

HSP70 家族是HSP 中最保守和最主要的一類，既往文獻(xiàn)研究表明，HSP70-2 基因多態(tài)性與免疫性疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其1267 位點(diǎn)A/G 位于編碼區(qū)，不影響蛋白質(zhì)中氨基酸順序，但影響HSP70 mRNA 的表達(dá)，GG 純合基因型較AA 及AG 型HSP70 mRNA 的表達(dá)低，從而影響HSP70的表達(dá)［11］。本研究發(fā)現(xiàn)GG 純合基因型頻率HSP 組高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示GG 純合基因型可能是HSP 發(fā)病的遺傳學(xué)易感因素。而非腎臟損害亞組和腎臟損害亞組其基因型頻率差異不顯著。HSP70-2 影響免疫性疾病的機(jī)制不明，目前有兩種觀點(diǎn):①與HSP70-2 基因多態(tài)性有關(guān)的免疫性疾病可能是由于HSP-HLA( 如HLA-DR3) 連鎖效應(yīng)參與發(fā)病，HSP70-2 基因多態(tài)性并非是單獨(dú)影響因素［12］；②可能存在HSP70-2 多態(tài)性致HSP mRNA 的表達(dá)不同，而與參與自身免疫反應(yīng)時(shí)的作用效應(yīng)有關(guān)［13］。此外，HSP70-2 的功能研究也需加強(qiáng)，以探索其在HSP 微血管病變過程中的作用。HSPN 為HSP 的嚴(yán)重并發(fā)癥。本研究腎損害亞組HSP70-2( +1267A/G) 基因型頻率與非腎損害亞組無明顯差異，提示該多態(tài)性并不增加HSPN 的易感性。SLE 與HSP 同為免疫性血管炎，有研究表明［13，14］HSP70 是美國黑人、白種人SLE 易感因素，HSP70-2 頻率增高是否增加HSPN 的易患性，仍有待更多不同種族、大樣本的研究以明確。由此也提示是否有其他遺傳因素或者環(huán)境因素、感染因素等促使部分免疫性疾病患者病變累及腎臟。

本研究結(jié)果顯示，HSP 組TNF-α -308 位點(diǎn)AA 基因型及A 等位基因頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜0.05) ，提示TNF-α -308 位點(diǎn)基因多態(tài)性與HSP 易感性有相關(guān)性。2004 年Yang 等［15］對29 例HSP 患兒和36 名健康兒童的TNF-α-308 位點(diǎn)基因多態(tài)性對比研究，未發(fā)現(xiàn)TNF-α-308 位點(diǎn)基因多態(tài)性與HSP 之間有相關(guān)性。與本研究結(jié)果不符，考慮可能是因?yàn)槠錁颖玖枯^小。本研究同時(shí)顯示，非腎臟損害亞組和腎損害亞組其基因型頻率及等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示與腎損害發(fā)展無明顯相關(guān)性。歐洲有報(bào)道TNF-α-308 位點(diǎn)基因型和等位基因與ERSD、IgAN 等腎臟疾病相關(guān)［16～19］，本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果不符的原因可能有: ①HSPN 與終末期腎病、IgA腎病等腎臟疾病有不同的易感基因型，目前研究多集中在TNF-α-308 位點(diǎn)基因多態(tài)性對終末期腎病等易感性的影響。②從遺傳角度看，機(jī)體對HSPN 易感性受多個(gè)基因共同影響；和其他易感基因相比，TNF-α -308 位點(diǎn)基因多態(tài)性可能對其影響的權(quán)重較小。③可能有人種以及地理位置的差異。

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