王 佶 安 宇 周水珍 王 藝 劉仁超

脊髓性肌萎縮癥( SMA) 是常染色體隱性遺傳性神經(jīng)肌肉病，人群中發(fā)病率為1/6 000 ～1/10 000 活產(chǎn)嬰兒，最近報(bào)道中國人群SMA 致病基因的攜帶者頻率為1/42［1］。SMA 居致死性常染色體隱性遺傳病第2 位，僅次于囊性纖維變性［2～4］。位于染色體5q11.2 ～q13.3 上的運(yùn)動神經(jīng)元存活( SMN) 基因是SMA 的主要致病基因，具有兩個(gè)高度同源的拷貝SMN1 和SMN2，兩者僅有5 個(gè)堿基的差別，分別位于第7、8 外顯子和第6、7 內(nèi)含子中。既往研究已證實(shí)SMN1 基因突變可導(dǎo)致SMA 發(fā)病，SMN2 基因是臨床表型的調(diào)節(jié)基因，拷貝數(shù)增加可減輕SMA 的表型［2，5］。近年來中國對SMN2 基因的研究較少［6，7］，缺乏表型與基因型的分析研究，同時(shí)SMA 基因診斷國內(nèi)多采用PCR-RFLP 分析技術(shù)，可判斷SMN 基因純合缺失，但不能分析雜合缺失。本研究納入臨床診斷的SMA 患兒，以多重連接探針擴(kuò)增( MLPA) 技術(shù)行SMN1 基因缺失和SMN2 基因拷貝數(shù)檢測，分析其與臨床表型關(guān)系，以豐富中國人群SMA 研究數(shù)據(jù)。

1 方法

1.1 SMA 診斷標(biāo)準(zhǔn)與分型 神經(jīng)?？漆t(yī)生根據(jù)發(fā)病年齡、臨床表現(xiàn)及病情進(jìn)展程度進(jìn)行臨床診斷［8］，檢測到SMN1 基因缺失可確診。根據(jù)1992 年國際SMA 協(xié)作組制定的兒童型SMA 的臨床分類標(biāo)準(zhǔn)，分為3 個(gè)亞型［8］:Ⅰ型:6 月齡內(nèi)發(fā)病，全身肌肉無力，肌張力減退，不能坐和站立，通常在2 歲內(nèi)死于呼吸衰竭； Ⅱ型:6 月齡后發(fā)病，能坐但不能獨(dú)自行走，多數(shù)在進(jìn)入青春期前死于呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥；Ⅲ型:18 月齡后發(fā)病，能坐和行走，預(yù)期壽命不減少，起病初可表現(xiàn)為走路不穩(wěn)和易跌倒等癥狀。

1.2 研究對象 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院( 我院) 臨床診斷為SMA 的患兒，納入SMN1 基因第7 和8 外顯子檢測到突變的確診病例，同時(shí)檢測患兒父母的SMN1 基因，分析雜合突變情況。本研究SMA 相關(guān)致病基因的檢測均獲得患兒家屬的口頭知情同意。

1.3 MLPA 拷貝數(shù)分析 采集患兒外周靜脈抗凝血3 mL，采用QIAgen 公司試劑盒( QIAamp DNA blood MiNi Kit 1250，Cat No.51106) 抽取DNA 溶液2 ～5 μg，-20℃保存。

參照SMA MLPA 檢測試劑盒( SALSA MLPA P060-B2 SMA probemix，MRC，荷蘭) 的操作說明進(jìn)行DNA 變性、探針雜交、連接和熒光引物PCR 擴(kuò)增，應(yīng)用ABI 公司的3130自動化序列分析儀進(jìn)行擴(kuò)增片段分離、峰高和峰面積的檢測。檢測數(shù)據(jù)應(yīng)用GENEMAKER 1.95 軟件分析處理。根據(jù)試劑盒的說明推算SMN1 和SMN2 基因第7 和8 外顯子的拷貝數(shù): SMN1 或SMN2 的信號與內(nèi)參信號的比值為0.7 ～1.3，拷貝數(shù)為2，表示為正常；比值為0.35 ～0.65，拷貝數(shù)為1，為雜合缺失； 比值為0 表示沒有拷貝，為純合缺失；比值為1.3 ～1.5，拷貝數(shù)為3；比值為1.5 ～2，拷貝數(shù)為4。以拷貝數(shù)2 為參照，多于2 個(gè)拷貝數(shù)即為重復(fù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料以表示，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，率的顯著性采用χ2檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 SMN1 基因拷貝數(shù)與臨床表型關(guān)系 41 例臨床診斷SMA 患兒進(jìn)行了基因檢測，37/41 例( 90.2%) SMN1 基因第7 和( 或) 第8 外顯子純合缺失進(jìn)入分析，其中36 例(97.3%) 為第7 和8 外顯子均純合缺失( 圖1A) ，1 例僅第7 外顯子純合缺失。男20 例，女17 例。平均發(fā)病年齡(7.5 ±7.0) 個(gè)月，3 d 至6 月齡19 例，～18 月齡14 例，～3歲2 例，＞3 歲2 例。Ⅰ型20 例( 54.1%) ，Ⅱ型15 例(40.5%) ，Ⅲ型2 例( 5.4%) ，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型平均發(fā)病年齡分別為(2.9 ±1.8) 、(10.7 ±1.9) 和(30.0 ±8.5) 個(gè)月。

2.2 SMN2 基因拷貝數(shù)與臨床表型關(guān)系 37 例SMN1 基因第7 和( 或)8 外顯子純合缺失患兒中，SMN2 基因第7 和8 外顯子拷貝數(shù)2 為18 例(48.6%) ，平均發(fā)病年齡(4.9 ±3.9) 個(gè)月，Ⅰ型13 例( 72.2%) ，Ⅱ型5 例( 27.8%) ； 第7和8 外顯子重復(fù)( 拷貝數(shù)3 或4) 為17 例( 45.9%) ( 圖1B) ，第7 外顯子重復(fù)為2 例( 5.4%) ，平均發(fā)病年齡( 9.9 ± 8.5) 個(gè) 月，Ⅰ型7 例( 36.8%) ，Ⅱ型10 例(52.6%) ，Ⅲ型2 例( 10.5%) ，Ⅱ和Ⅲ型的比例顯著高于拷貝數(shù)2 的病例( P ＜0.05) 。

圖1 SMA 患兒SMN1 和SMN2 基因MLPA 檢測結(jié)果Fig 1 The results of SMN1 and SMN2 gene detection with MLPA method in SMA children

2.3 SMN1 基因雜合缺失與表型 5 例患兒父母行SMN1基因檢測，檢出雜合缺失9 例，其中4 例患兒父母均為SMN1 基因第7 和8 外顯子雜合缺失( 圖1C) ；1 例患兒父親為SMN1 基因第7 和8 外顯子雜合缺失，母親未檢測到純合或雜合缺失。5 例患兒父母均未見肌肉無力及萎縮等臨床表現(xiàn)。另有1 例檢出SMN1 基因第7 和第8 號外顯子雜合缺失，其臨床特征、肌電圖及肌肉活檢均符合SMAⅠ型的診斷，尚待SMN1 基因測序明確是否存在SMN 基因點(diǎn)突變。

3 討論

SMA 的輔助檢查主要有肌電圖、肌酶和肌肉活檢。肌電圖是定位診斷，但特異度不高。肌酶在鑒別其他肌無力疾病中有參考意義，但對SMA 診斷無特異性。肌肉活檢由于取材的創(chuàng)傷性，患兒不易接受，因此SMA 的基因檢測受到臨床的青睞。既往采用的PCR-RFLP 法由Lefebvre 等［9］建立，除不能分析雜合突變外，實(shí)驗(yàn)要求高、操作繁瑣和穩(wěn)定性差等限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。國內(nèi)也有采用熒光定量PCR 技術(shù)檢測SMN 基因拷貝數(shù)的報(bào)道，該方法檢測靈敏，但因優(yōu)化為穩(wěn)定和高效的實(shí)驗(yàn)體系較困難，且不同實(shí)驗(yàn)室采用不同的內(nèi)參照無法互相比較，對于重復(fù)大于3 以上的拷貝數(shù)難以準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，其用于臨床檢測的實(shí)用性不如MLPA。MLPA 是一種高通量、針對待測核酸中靶序列進(jìn)行定性和半定量分析的技術(shù)［10］，可對待測基因所有外顯子進(jìn)行缺失、重復(fù)及某些點(diǎn)突變檢測［11］，國外已有采用該技術(shù)分析SMN 基因純合缺失、雜合缺失和拷貝數(shù)的報(bào)道［12，13］。我院自2011 年10 月起在臨床應(yīng)用MLPA 技術(shù)用于SMA的診斷。

研究表明80% ～90%的SMA 為SMN1 基因純合缺失，5% ～10%的SMA 是由于SMN1 基因發(fā)生復(fù)合雜合突變所致，即一個(gè)SMN1 等位基因缺失，另一個(gè)SMN1 等位基因發(fā)生點(diǎn)突變［14，15］。歐美人群中SMN1 基因純合缺失檢測已成為診斷和排除診斷SMA 的首選方法［16］。本文41 例臨床診斷SMA 患兒SMN1 基因第7 和( 或) 8 外顯子純合缺失檢出率為90.2%，提示可作為SMA 患兒的首選確診方法，特別是松軟嬰兒( floppy infant) 在嬰兒期臨床表現(xiàn)難以做出臨床診斷時(shí)，且肌電圖不能做出定性診斷時(shí)，肌肉活檢對于小嬰兒也存有一定困難時(shí)，基因檢測的價(jià)值更大。本文9/10 名患兒父母檢出雜合缺失，但均無臨床表現(xiàn)，為攜帶者；提示檢測雜合突變一方面可以防止漏診，另一方面也可為產(chǎn)前診斷和咨詢提供依據(jù)。

SMN2 基因產(chǎn)生10%全長轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，是臨床表型的調(diào)節(jié)基因，基因拷貝數(shù)越多，產(chǎn)生全長轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也增多［5］，可部分補(bǔ)償SMN 蛋白的不足，減輕SMA 表型嚴(yán)重程度［17］，也可預(yù)測SMA 急性或慢性病程［18］。Feldkǒtter 等［2］對375例SMA 病例的研究也顯示，SMN2 基因拷貝數(shù)與SMA 表型嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。本文采用MLPA 技術(shù)對SMN2 基因拷貝數(shù)變異檢測，顯示拷貝數(shù)為2 個(gè)的18 例患兒平均發(fā)病年齡較早［(4.9 ±3.9) 個(gè)月］，其表型以Ⅰ型為主( 13 例) ；SMN2 基因拷貝數(shù)3 或4 患兒的平均發(fā)病年齡稍晚［(9.9 ±8.5) 個(gè)月］，表型以Ⅱ型為主( 10/17 例) ，提示基因拷貝數(shù)檢測可作為臨床判斷SMA 預(yù)后的方法之一。

本文的局限性:SMA Ⅲ型患兒例數(shù)較少，且未進(jìn)一步細(xì)化分析臨床表型和基因拷貝數(shù)的相關(guān)性，待今后研究進(jìn)一步完善。

致謝:感謝參加本研究的患兒及家屬；感謝復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院神經(jīng)科醫(yī)生和兒科研究所技術(shù)人員的支持。

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