田 蘭，張繼春，陳 睿，儲(chǔ)忠英，包綜方

(上海市松江食品藥品檢驗(yàn)所，上海 201600)

目前，失眠的人群越來越多，有一部分人不得不借助鎮(zhèn)靜安神類藥物維持正常的睡眠和生活。多數(shù)人認(rèn)為中藥和保健品作用較緩和、不良反應(yīng)小，更喜歡使用中藥制劑和保健品，但個(gè)別不法商家為牟取暴利，在中藥制劑及保健品中非法添加鎮(zhèn)靜催眠類化學(xué)藥，以增強(qiáng)藥效，這不僅使中成藥原有的藥效可能發(fā)生改變，同時(shí)也使患者的用藥安全得不到應(yīng)有的保障[1]。此類藥物也不可避免地存在某些副作用，如出現(xiàn)困倦、嗜睡、乏力、頭暈，大劑量使用時(shí)可引起共濟(jì)失調(diào)、暫時(shí)性的遺忘和意識障礙，嚴(yán)重時(shí)還可能導(dǎo)致昏迷、呼吸抑制。此外，安眠藥還具有易產(chǎn)生耐受性和依賴性的特點(diǎn)[2]。況且，該類藥物的半衰期很長，達(dá)50 h。本試驗(yàn)中選擇了氯硝西泮、氯氮、艾司唑侖、阿普唑侖、地西泮、硝西泮、三唑侖、奧沙西泮和馬來酸咪達(dá)唑侖9種易被非法添加的藥物為檢測對象。目前根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件匯編有關(guān)規(guī)定測定這9種化學(xué)藥物的方法有薄層色譜法、高效液相色譜－串聯(lián)四級桿質(zhì)譜(HPLC－MS/MS)法分別測定[3]。筆者建立了同時(shí)測定非法添加9種化學(xué)藥品的超高效液相色譜－串聯(lián)四級桿質(zhì)譜(UPLC－MS/MS)法，為強(qiáng)有力打擊制假售假違法者提供技術(shù)保障和科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters ACQUITY UPLC Quattro MicroTM超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，MassLynx4.1質(zhì)譜工作站。對照品氯硝西泮(批號為 171227－200302)、氯氮(批號為 171248－200301)、艾司唑侖(批號為 1219－0102)、阿普唑侖(批號為 171218－200603)、地西泮(批號為 171225－200302)、硝西泮(批號為171217－200402)、三唑侖(批號為 1230－9701)、奧沙西泮(批號為 171229－200603)和馬來酸咪達(dá)唑侖(批號為 171250－201002，含量為99.9%)均由中國藥品生物制品檢定所提供;樣品由藥監(jiān)分局監(jiān)督抽驗(yàn);甲醇為色譜純(購自Merk公司)，甲酸選用進(jìn)口色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測條件

色譜條件:Acquity UPLC超高效液相色譜系統(tǒng)，Acquity BEH C18柱(2.1 mm × 50 mm，1.7 μm);流動(dòng)相 A 為甲醇，流動(dòng)相B為0.1%甲酸溶液，按表1進(jìn)行梯度洗脫;流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量 5 μL，柱溫為 35 ℃。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表

質(zhì)譜條件:Quattro MicroTM三重四級桿質(zhì)譜，離子化模式為ESI+，檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);毛細(xì)管電壓3 kV;脫溶劑氣溫度350℃，脫溶劑氣流量600 L/h;錐孔反吹氣30 L/h。錐孔電壓和碰撞能量見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

2.2 質(zhì)譜分析及定性、定量

以電噴霧離子化方式對9種藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行MS掃描，9種化合物均形成[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，以此作為母離子，進(jìn)行碎片掃描，選擇豐度較強(qiáng)的2個(gè)子離子。經(jīng)試驗(yàn)，9種化合物均在正離子檢測方式下具有較高的靈敏度，因此采用正離子檢測的方式進(jìn)行UPLC－MS/MS分析。定性鑒別時(shí)，以化合物的保留時(shí)間及2組離子對進(jìn)行確認(rèn)。定量測定時(shí)以定量離子對的響應(yīng)做外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。9種化合物的總離子流圖(TIC)見圖1，二級質(zhì)譜圖見圖2。

圖1 9種化合物的總離子流圖

2.3 溶液制備

混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液:精密稱取經(jīng)60℃減壓干燥的9種藥物的對照品適量，用甲醇溶解并制成每mL含有50 μg的標(biāo)準(zhǔn)貯備液并保存于冰箱中。

供試品溶液:對于片劑，取10片，研細(xì);對于膠囊劑，取10粒膠囊，將內(nèi)容物取出，必要時(shí)研磨，將膠囊殼剪碎，與內(nèi)容物混勻;對于蜜丸，將蜜丸粉碎成細(xì)小顆粒;對于顆粒劑，取5袋，研細(xì)。稱取處理好的樣品的一次口服用量，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇約70 mL，超聲提取20 min，放冷至室溫，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)過夜沉淀后取上層溶液適量，高速離心(不小于105/min)，取上清液用流動(dòng)相溶液稀釋10～100倍，即可。

2.4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:分別精密吸取2.3項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，用甲醇稀釋成 25，50，100，250，500，600，800，1 000 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)系列濃度溶液，進(jìn)行UPLC－MS/MS測定。以化合物定量離子對的峰面積(Y)對相應(yīng)的質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，見表3。

圖2 9種化合物的二級質(zhì)譜圖

表3 9種化合物線性關(guān)系

重復(fù)性試驗(yàn):精密稱取陽性樣品平行6份，每份1次口服用量，照2.3項(xiàng)下方法制得供試品溶液，進(jìn)樣5 μL。結(jié)果檢出地西泮，其余均未檢出(圖3)。根據(jù)地西泮的定量離子峰面積，計(jì)算地西泮的平均含量為 0.521 82 mg/g，RSD 為 1.2%(n=6)。

精密度試驗(yàn):取300 μg/L加標(biāo)水平混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在擬訂的UPLC－MS/MS條件下連續(xù)測定6次，由氯硝西泮、氯氮、艾司唑侖、阿普唑侖、地西泮、硝西泮、三唑侖、奧沙西泮和馬來酸咪達(dá)唑侖定量離子對峰面積計(jì)算精密度，RSD分別為4.9%，1.3%，1.8% ，3.6%，2.1%，2.6% ，6.6%，1.3% ，1.5%(n=6)。

檢測限和定量限:取混合對照品貯備液，用甲醇稀釋成一定質(zhì)量濃度的溶液后測定各化合物的信噪比，依據(jù)檢出限為3倍信噪比(S/N=3)，定量限為10倍信噪比(S/N=10)，分別得出各化合物的檢測限:氯硝西泮1×10－3ng、氯氮0.2 ×10－3ng、艾司唑侖 0.2 ×10－3ng、阿普唑侖 0.3 ×10－3g、地西泮 1.5 ×10－3ng、硝西泮 0.3×10－3ng、三唑侖 1.2 ×10－3ng、奧沙西泮 0.2×10－3ng 和馬來酸咪達(dá)唑侖 0.2 ×10－3ng。定量限:氯硝西泮 3 ×10－3ng、氯氮卓 0.7 ×10－3ng、艾司唑侖 0.6 ×10－3ng、阿普唑侖 1 ×10－3g、地西泮 5×10－3ng、硝西泮 1×10－3ng、三唑侖 4×10－3ng、奧沙西泮0.6×10－3ng和馬來酸咪達(dá)唑侖 0.6 ×10－3ng。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取300 μg/L加標(biāo)水平混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在配制后于室溫下放置 0，3，6，12，18，24 h 時(shí)測定，根據(jù)地西泮、氯硝西泮和艾司唑侖定量離子對峰面積計(jì)算精密度，RSD分別為5.1% ，1.5% ，2.0% ，3.9% ，2.2% ，2.9% ，6.6% ，1.8% ，1.7%(n=6)。結(jié)果表明，9種化合物在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

圖3 樣品的多反應(yīng)監(jiān)測圖

加樣回收試驗(yàn):精密稱取陰性樣品9份，分別精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，照2.3方法提取，終質(zhì)量濃度分別為200，300，500 μg/L，每個(gè)質(zhì)量濃度水平平行試驗(yàn)3份，根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算9種化合物的平均回收率。結(jié)果見表4。

專屬性試驗(yàn):分別取約3 g空白制劑的粉末和添加了檢測限濃度的9種鎮(zhèn)靜催眠藥的相同制劑粉末，按照2.3項(xiàng)下方法制備。所得到的定量離子對多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖表明，在9種鎮(zhèn)靜催眠藥的出峰位置，空白樣品中無干擾峰出現(xiàn)，該方法具有較好的專屬性。

2.5 樣品檢測

樣品按2.5項(xiàng)下方法制備，在擬訂的UPLC－MS/MS條件下測定，結(jié)果11批抽驗(yàn)樣品其中2批檢出地西泮，其余均無非法添加。

3 討論

由于中藥成分的復(fù)雜性，故有必要采用高選擇性的分析手段。本法可快速、準(zhǔn)確地對中藥制劑及保健品中非法添加氯硝西泮、氯氮、艾司唑侖、阿普唑侖、地西泮、硝西泮、三唑侖、奧沙西泮和馬來酸咪達(dá)唑侖同時(shí)進(jìn)行檢測，專屬性強(qiáng)，9種化合物可達(dá)基線分離，分離速度快。

本法建立了鎮(zhèn)靜安神類中成藥及保健品中非法添加9種化合物的專屬檢測方法。試驗(yàn)考察了乙腈－水和甲醇－水體系為流動(dòng)相對目標(biāo)化合物的分離效果，結(jié)果表明，這兩種體系為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)化合物的質(zhì)譜信號響應(yīng)存在差別，甲醇－水體系靈敏度高且噪音小，且安全和經(jīng)濟(jì)性較乙腈－水好，綜合考慮選擇甲醇－水體系為流動(dòng)相。在建立方法時(shí)分別采用等度洗脫和梯度洗脫的方法進(jìn)行比較，結(jié)果梯度洗脫分離速度明顯比等度洗脫快且分離效果好，因此采用0.1%甲酸－甲醇梯度洗脫。

ESI(+)模式下，常采用加入揮發(fā)性酸以降低流動(dòng)相的pH，有助于待測藥物的離子化。在ESI中，流速大意味著同時(shí)進(jìn)入離子源的化合物也增多。需要同時(shí)離子化的化合物增多，加劇了待測成分與基質(zhì)成分在電離過程的競爭，從而使待測成分的響應(yīng)降低。此外，在低流速下可產(chǎn)生較細(xì)的霧滴，而使霧滴的總表面積增加，待測成分與基質(zhì)成分在表面積的競爭減少，從而有利于產(chǎn)生氣相離子，提高待測成分的信號強(qiáng)度。該試驗(yàn)中選擇流速為0.3 mL/min，既避免了待測成分因出峰過快而易受雜質(zhì)峰的干擾，同時(shí)又最大程度地縮短了分析時(shí)間，滿足了實(shí)際應(yīng)用中復(fù)雜中藥樣品的測定。

表4 9種化合物的回收率(n=9)

[1]李欣榮，陳安珍，楊 釗.UPLC－MS/MS檢測消腫止痛類中成藥中違禁添加的雙氯芬酸鈉和氨基比林[J].藥物分析雜志，2010，30(7):1 294.

[2]Peng Z，Sharon SY，Peiling H，et al.Simultaneous determination of synthetic phosphodiesterase－5 inhibitors found in a dietary supplement and pre mixed bulk powders for dietary supplements using high－performance liquid chromatography with diode array detection and liquid chromatography－electrosp ray ionization tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr A，2006，1 104:113 －122.