肖慧媚廖建湘蔣莉

微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一類長度約為22個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA，其功能是精確調(diào)節(jié)神經(jīng)元及其他細(xì)胞的發(fā)育、分化、增殖、凋亡，以及參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、神經(jīng)元可塑性及信號傳導(dǎo)中的mRNA轉(zhuǎn)錄后處理[1]。特定的血清miRNA表達(dá)譜可能成為癌癥及其他疾病的診斷新型檢測指標(biāo)[2]。目前認(rèn)為miR-146a、miR-23a與癲癇的發(fā)生密切相關(guān)[3，4]。耐藥性癲癇的耐藥機制不明確，且無明確的生物學(xué)診斷指標(biāo)。本研究用Hiseq測序法及實時熒光定量PCR檢測血清miR-146a-5p和miR-23a-3p的表達(dá)水平，探討其在耐藥性癲癇診療中臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象本研究耐藥組納入標(biāo)準(zhǔn)：耐藥性癲癇的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]根據(jù)國際抗癲癇聯(lián)盟規(guī)定，癲癇患兒在經(jīng)過正確使用兩種治療方案，具有足夠的療程及劑量治療的情況下，仍未能達(dá)到無發(fā)作情形者為兒童耐藥性癲癇(即：癲癇無發(fā)作少于3倍治療前最長發(fā)作間隔或無發(fā)作短于12個月)。非耐藥組納入標(biāo)準(zhǔn)：使用抗癲癇藥物前3個月發(fā)作次數(shù)大于3次，采用一種抗癲癇藥物，持續(xù)6個月以上無發(fā)作。排除標(biāo)準(zhǔn)：有進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，遺傳代謝病或顱內(nèi)占位性疾病，肝腎功能不全，未規(guī)律服藥等病史患者。收集2011年6月至2012年11月本院就診的新診斷癲癇患兒70例。男27例，女43例，年齡5個月～3歲。隨訪后確診其中35例為耐藥性癲癇，35例為非耐藥性癲癇。采集所有新診斷癲癇患兒用藥前及達(dá)到入組標(biāo)準(zhǔn)用藥后靜脈血標(biāo)本各70份。收集同期在本院已經(jīng)確診為耐藥性癲癇用藥后標(biāo)本33例、非耐藥性癲癇用藥后標(biāo)本29例，男27例，女35例，年齡9個月～6歲。收集同期在本院體檢健康者55例作為健康對照組，男25例，女30例，年齡5個月～5歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得各研究對象監(jiān)護人的知情同意。采集各研究對象的空腹靜脈血5 mL，4℃、1500r/min離心5 min,收集血清后再4℃、3000r/min離心3 min，收集血清于EP管中，-80℃保存。

1.2 主要儀器及試劑 miRneasy Mini Kit、miScriptⅡRT Kit、內(nèi) 參 Syn-celmiR-39-3p、miScript SYBR Green PCR Kit(德國Qiagen公司)，LightCycler 480實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)，X-12R臺式低溫離心機(德國貝克曼公司)，Veriti96-W梯度PCR儀(美國ABI公司)。

1.3 Hisqe測序?qū)?5例耐藥性癲癇及35例非耐藥性癲癇患兒用藥后血清送至深圳華大基因研究院進(jìn)行血清總RNA提取、Hiseq測序及miRNA表達(dá)量差異性分析(項目編號：F12FTSSCKF0066)。

1.4 血清RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄取200μL血清，按miRneasy Mini Kit說明書操作提取RNA；按照miS-criptⅡRT Kit說明書操作提取進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)cDNA，樣本cDNA-20℃冰箱保存。

1.5 實時熒光定量PCR miR-23a-3p、miR-146a-5p、Syn-cel-miR-39-3p三種引物由德國QIAGEN公司設(shè)計和合成。PCR反應(yīng)總體系為15μL，包括2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 7.5μL,10×miScript通用型引物1.5μL,10×miScript特異性引物 1.5μL,ddH2O 3.5μL,cDNA 1μL。循環(huán)參數(shù)：94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，共45個循環(huán)。采用相對定量法，結(jié)果以2-ΔΔCt表示。其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt患者樣本-ΔCt健康對照。2-ΔΔCtt為癲癇患兒目的基因表達(dá)相對于健康對照組的倍數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析Hiseq測序結(jié)果使用log2-ratio、Scatter plot圖比較兩者共同表達(dá)的miRNA表達(dá)量的差異，以fold-change≥1.0或者≤0.5時認(rèn)為miRNAs的表達(dá)有明顯差異性，具有統(tǒng)計學(xué)意義[6]；RT-qPCR結(jié)果用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布，計量資料以xˉ±s表示，耐藥性癲癇與非耐藥性癲癇比較用獨立樣本t檢驗，耐藥組用藥前后比較及非耐藥組用藥前后比較用配對樣本t檢驗，檢測水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Hiseq測序結(jié)果 測序結(jié)果顯示，與非耐藥性癲癇患兒比較，78種miRNA在耐藥性癲癇患兒中表達(dá)上升(let-7c、let-7g-5p、miR-100-5p、miR-101-3p、miR-106b-3p、miR-106b-5p、miR-107、miR-10a-5p、miR-10b-5p、miR-1185-1-3p、miR-126-3p、miR-127-3p、miR-1277-5p、miR-140-3p、miR-142-5p、miR-144-5p、miR-146a-5p、miR-146b-5p、miR-148b-3p、miR-16-2-3p、miR-16-5p、miR-17-5p、miR-181b-5p、miR-182-5p、miR-183-5p、miR-185-5p、miR-191-5p、miR-192-5p、miR-199a-3p、miR-199b-3p、miR-19a-3p、miR-203a、miR-20a-5p、miR-215、miR-221-3p、miR-23a-3p、miR-25-5p、miR-26a-5p、miR-26b-5p、miR-27a-3p、miR-301a-3p、miR-30a-5p、miR-30b-3p、miR-30d-5p、miR-30e-5p、miR-3199、miR-345-5p、miR-3613-5p、miR-363-3p、miR-374a-5p、miR-375、miR-378d、miR-381-3p、miR-410、miR-411-5p、miR-423-3p、miR-424-5p、miR-425-5p、miR-4286、miR-450b-5p、miR-451a、miR-454-3p、miR-4646-5p、miR-4732-3p、miR-486-3p、miR-486-5p、miR-493-5p、miR-500a-3p、miR-501-3p、miR-502-3p、miR-532-5p、miR-598、miR-660-5p、miR-92a-3p、miR-92b-3p、miR-93-5p、miR-98-5p、miR-99b-5p)；22種miRNA表達(dá)下降(let-7d-5p、let-7e-5p、miR-1294、miR-130a-3p、miR-150-5p、miR-151a-3p、miR-151a-5p，miR-151b、miR-181a-3p、miR-186-5p、miR-21-3p、miR-222-3p、miR-320a、miR-320b、miR-339-5p、miR-378a-3p、miR-378c、miR-4454、miR-574-5p、miR-582-3p、miR-744-5p、miR-584-5p)，差異性表達(dá)見圖1。其中miR-146a-5p、miR-23a-3p 的 fold-change＞1.0(分別為1.241和1.302)。

2.2 RT-qPCR檢測結(jié)果

2.2.1 耐藥性癲癇患兒、非耐藥性癲癇患兒用藥前血清miR-146a-5p、miR-23a-3p表達(dá)量比較與非耐藥性癲癇相比較，耐藥性癲癇用藥前血清miR-146a-5p、miR-23a-3p的表達(dá)量均上升，具有統(tǒng)計學(xué)差異性(P＜0.05)，見表1。

2.2.2 耐藥性癲癇患兒、非耐藥性癲癇患兒用藥后血清miR-146a-5pmiR-23a-3p表達(dá)量比較 與非耐藥性癲癇相比較，耐藥性癲癇患兒用藥后血清中miR-146a-5p、miR-23a-3p表達(dá)水平均上升(P＜0.05)，見表2。

2.2.3 耐藥性癲癇用藥前后血清miR-146a-5p、miR-23a-3p表達(dá)量比較 與耐藥性癲癇用藥后相比較，耐藥性癲癇血清miR-146a-5p、miR-23a-3p用藥前的表達(dá)量與用藥后的表達(dá)量無明顯統(tǒng)計學(xué)差異性(P＞0.05)，見表3。

2.2.4 非耐藥性癲癇用藥前后血清miR-146a-5p、miR-23a-3p表達(dá)量比較 與非耐藥性癲癇用藥后相比較，非耐藥性癲癇血清miR-146a-5p、miR-23a-3p用藥前的表達(dá)量與用藥后的表達(dá)量無明顯統(tǒng)計學(xué)差異性(P＞0.05)，見表4。

3 討論

圖1 耐藥性癲癇與非耐藥性癲癇患兒miRNA譜差異性表達(dá)結(jié)果

不同病理狀態(tài)下一些miRNAs的改變可以穩(wěn)定、特異性地反映體液，尤其是血清中的表達(dá)情況。本研究Hiseq測序結(jié)果顯示，耐藥性癲癇患兒較非耐藥性癲癇患兒用藥后血清中78種miRNA表達(dá)上升，22種miRNA表達(dá)下降。由于本實驗是前瞻性研究，患者隨訪時間最短3個月，用藥前血清在-80℃冰箱保存長達(dá)3個月以上，Hiseq測序結(jié)果顯示用藥前的血清miRNA存在較多的降解，故用藥前的血清miRNA表達(dá)譜有待進(jìn)一步改進(jìn)研究。然而RT-qPCR所用的用藥前標(biāo)本是血清及時處理并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，其結(jié)果是可信的。比較miR-146a-5p、miR-23a-3p在耐藥性癲癇用藥前后的表達(dá)水平及非耐藥性癲癇用藥前后的表達(dá)水平，本研究發(fā)現(xiàn)二者在用藥前后的表達(dá)水平無明顯統(tǒng)計學(xué)差異性，推測抗癲癇藥物可能對血清miR-146a-5p、miR-23a-3p的表達(dá)無明顯作用。與非耐藥性癲癇用藥前比較，RT-qPCR結(jié)果顯示miR-146a-5p、miR-23a-3p在耐藥性癲癇用藥前血清中表達(dá)水平明顯升高，表明在初診斷癲癇時，這兩種miRNA可能成為耐藥性癲癇的早期診斷生物標(biāo)記物和癲癇預(yù)后的評價指標(biāo)。

表1 耐藥性癲癇患兒與非耐藥性癲癇患兒用藥前血清中miR-146a-5p、miR-23a-3p表達(dá)比較

表2 耐藥性癲癇與非耐藥性癲癇用藥后血清miR-146a-5p、miR-23a-3p表達(dá)比較

表3 耐藥性癲癇用藥前后血清中miR-146a-5p、miR-23a-3p表達(dá)量的比較

表4 非耐藥性癲癇用藥前后血清中miR-146a-5p、miR-23a-3p表達(dá)量的比較

miRNA參與了神經(jīng)系統(tǒng)的生理學(xué)過程及信號通路的基因表達(dá)調(diào)控，如神經(jīng)干細(xì)胞分化、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生和發(fā)育、樹突棘形成、突觸聯(lián)系和神經(jīng)保護等[7]。目前多數(shù)研究認(rèn)為，血清miRNA來源主要從患者組織細(xì)胞中主動分泌進(jìn)入血循環(huán)，血清miRNA表達(dá)水平可以反映病變組織內(nèi)的情況。Hu等[8]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠癲癇模型中大腦組織與外周血中的miRNA表達(dá)的變化趨勢一致，二者有高度的相關(guān)性。

miR-146a是一種調(diào)節(jié)Toll樣受體(TLR)信號通路和細(xì)胞因子受體信號通路的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，miR-146a與炎癥性疾病有著密切關(guān)系[9]。Vezzani等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在嚙齒類動物癲癇模型的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)炎癥因子(如IL-1b和TNF-α)表達(dá)量明顯升高，表明炎癥反應(yīng)對癲癇的發(fā)生發(fā)展有著重要的作用。Aronica等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠癲癇模型和癲癇患者海馬區(qū)的miR-146a均表達(dá)升高。Ahmed等研究[3]顯示，在兒童顳葉內(nèi)側(cè)癲癇病變區(qū)的炎癥因子IL-1β及miR-146a的表達(dá)升高。本研究結(jié)果表明，miRNA-146a-5p在耐藥性癲癇患兒血清的表達(dá)量明顯高于非耐藥性癲癇，推測miR-146a-5p過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)從而調(diào)控耐藥性癲癇的發(fā)生、發(fā)展。

miR-23a在膠質(zhì)瘤Ⅱ、Ⅲ級中表達(dá)逐漸上調(diào),以在膠質(zhì)瘤Ⅲ級中表達(dá)水平最高,由此表明miR-23參與調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增生分化。Song[4]等研究發(fā)現(xiàn)，匹羅卡品所致顳葉癲癇大鼠模型的癲癇持續(xù)狀態(tài)后24 h海馬中的miR-23a表達(dá)量上升，同期大鼠海馬中的突觸重建活躍。大量研究表明耐藥性癲癇耐藥機制與膠質(zhì)細(xì)胞增生、突觸重建密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,miR-23a-3p在耐藥性癲癇患兒血清中表達(dá)較非耐藥性癲癇上升，表明miR-23a-3p可能是調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增生以及突觸重建調(diào)控著耐藥性癲癇的形成。

總之，本研究首次對耐藥性癲癇血清miR-146a-5p、miR-23a-3p表達(dá)水平進(jìn)行探討，二者可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生、突觸重建、炎癥反應(yīng)等參與調(diào)控耐藥性癲癇的發(fā)生發(fā)展。為我們研究耐藥性癲癇提供一個新的研究方向和思路，但具體作用機制有待進(jìn)一步研究。

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