馮金洲張廣慧燕偉平秦新月

雌激素用于治療多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)已有報(bào)道，但因作用機(jī)制和潛在風(fēng)險(xiǎn)未完全明確，故臨床應(yīng)用仍存爭(zhēng)議。在MS的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)模型中抑制Rho激酶的表達(dá)能減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、脫髓鞘程度及臨床癥狀[1-2]，提示Rho激酶參與EAE病理過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)雌激素可抑制Rho激酶的活性，但具體機(jī)制不詳[3]。本研究擬探討雌激素對(duì)EAE大鼠Rho激酶表達(dá)的影響，并通過(guò)NF-κB特異性抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidine dithocarbamate，PDTC)干預(yù)，進(jìn)一步了解雌激素在EAE/MS發(fā)揮抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究材料 380～450 g豚鼠8只，雌雄不限，重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。180～220g雌性Wistar大鼠60只，第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為模型組、對(duì)照組、PDTC組、雌激素組，每組15只。

1.2 研究方法

1.2.1 EAE模型的制備 Wistar大鼠行雙側(cè)輸卵管結(jié)扎及卵巢摘除，術(shù)后2周wistar大鼠身體狀況恢復(fù)后制備EAE模型。新鮮豚鼠脊髓制成50%脊髓生理鹽水勻漿與完全弗氏佐劑按照1：1制成油包水乳劑，皮下注射共0.5 mL/只。同時(shí)于雙后肢足背皮下注射百日咳毒素0.2 mL/只[4]。

1.2.2 處理方式 對(duì)照組只給予皮下注射二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)。PDTC組于免疫前1d起腹腔注射PDTC(sigma)50 mg/(kg·d)[5]，連續(xù)10d。雌激素組大鼠于免疫前1日起腹部皮下注射17β-雌二醇(sigma)20μg/(kg·d)[6]，連續(xù)10 d。

1.2.3 神經(jīng)功能評(píng)分 自免疫日起采用5分評(píng)分法每日行EDSS神經(jīng)功能評(píng)分(0分：正常，無(wú)發(fā)??；1分：動(dòng)物尾無(wú)力；2分：雙后肢無(wú)力；3分：雙后肢麻痹；4分：雙后肢加前肢癱瘓；5分：瀕死狀態(tài)或死亡[7]。癥狀介于兩級(jí)之間則分別記作0.5、1.5、2.5、3.5或4.5分)。以達(dá)到或超過(guò)1分為臨床發(fā)病，自免疫日起至臨床發(fā)病的時(shí)間為發(fā)病潛伏期。

1.2.4 炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況檢測(cè) 免疫后16 d統(tǒng)一處死取腦組織制作石蠟切片(4μm)，行H-E染色觀(guān)察腦組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.2.5 Rho激酶和NF-κB P65的表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化與western blot方法觀(guān)察腦組織Rho激酶和NF-κB P65的表達(dá)情況。

免疫組化：參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，光鏡下顯色細(xì)胞膜、細(xì)胞漿棕黃色顆粒(ROCK-Ⅱ，abcam)或細(xì)胞漿、細(xì)胞核棕黃色顆粒(NF-κB P65，santa cruz)為陽(yáng)性著色。

Western blot：取新鮮腦組織提取全蛋白，具體方法參照文獻(xiàn)[8]，以蛋白/β-actin條帶密度的相對(duì)值表示蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料均以(x±s)表示，發(fā)病率的比較采用χ2檢驗(yàn)；四組間計(jì)量資料的比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonfferoni法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為學(xué)比較 該模型表現(xiàn)為急性單相病程。EAE模型組發(fā)病12只，對(duì)照組13只，PDTC組和雌激素組各10只，組間發(fā)病率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=5.40，P＞0.05)。EAE模型組、對(duì)照組、PDTC組和雌激素組最高神經(jīng)功能評(píng)分分別為(2.27±0.36)分、(2.15±0.31)分、(1.93±0.42)和(1.54±0.25)分。4組間最高神經(jīng)功能評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=10.67，P＜0.05)，其中雌激素組比EAE模型組降低(P＜0.05)。

EAE模型組、對(duì)照組、PDTC組和雌激素組發(fā)病潛伏期分別為(12.95±0.75)d、(12.35±1.02)d、(13.75±0.96)d和(15.10±0.87)d，4組間潛伏期有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=24.69，P＜0.05)。與EAE模型組比較，雌激素組發(fā)病潛伏期延長(zhǎng)(P＜0.05)。對(duì)照組與EAE模型組潛伏期與神經(jīng)功能評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

2.2 各組大鼠炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況 HE染色示模型組腦組織存在明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管周?chē)省靶涮讟印钡湫脱装Y性改變，腦實(shí)質(zhì)內(nèi)亦有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖1 A)；PDTC組和雌激素組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)比EAE模型組明顯減輕，血管“袖套樣”炎性改變不明顯，腦實(shí)質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)亦明顯減少(見(jiàn)圖1 B和C)。

2.3 EAE大鼠腦組織NF-κB P65的表達(dá) 免疫組化示腦組織中P65主要表達(dá)在大腦皮質(zhì)和海馬，各組間表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=137.60，P＜0.05)。EAE模型組及對(duì)照組間表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，陽(yáng)性染色除在細(xì)胞漿外，還有大量轉(zhuǎn)錄入核。而PDTC組和雌激素組表達(dá)水平較EAE模型組明顯降低(P＜0.01)，且多位于細(xì)胞漿中，細(xì)胞核激活狀態(tài)的NF-κB表達(dá)很少(見(jiàn)表1及圖2 A～D)。

Western blot示EAE模型組、對(duì)照組、PDTC組和雌激素組P65表達(dá)相對(duì)值分別為(0.97±0.05)、(1.11±0.07)、(0.53±0.06)和(0.64±0.07)。4組間表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=5.88，P＜0.05)，對(duì)照組與模型組表達(dá)無(wú)差異(P＞0.05)，PDTC組、雌激素組與EAE模型組相比有差異(P＜0.01)，PDTC組與雌激素組之間有差異(P＜0.05)，以PDTC組表達(dá)最低(見(jiàn)圖3)。

2.4 EAE大鼠腦組織Rho激酶表達(dá) 免疫組化結(jié)果示，腦組織Rho激酶主要表達(dá)在大腦皮質(zhì)和海馬，與NF-κB P65的表達(dá)部位一致，陽(yáng)性染色主要見(jiàn)于細(xì)胞膜，少部分位于細(xì)胞漿(見(jiàn)圖2 E～H)。4組Rho激酶表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=86.82，P＜0.05)，在EAE模型組及對(duì)照組兩組間表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；而PDTC組和雌激素組與EAE模型組比較則表達(dá)減少(P＜0.01)(見(jiàn)表1)。

Western blot示EAE模型組、對(duì)照組、PDTC組和雌激素組Rho激酶表達(dá)相對(duì)值分別為(0.87±0.05)、(0.85±0.09)、(0.37±0.05)和(0.41±0.07)。各組間表達(dá)有明顯差異(F=8.43，P＜0.05)，對(duì)照組與模型組表達(dá)無(wú)差異(P＞0.05)，PDTC組、雌激素組與模型組相比表達(dá)有差異(P＜0.01)，PDTC組與雌激素組間表達(dá)無(wú)差異(P＞0.05)(見(jiàn)圖4)。

3 討論

雌激素治療MS機(jī)制包括抑制T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和炎性因子生成，調(diào)節(jié)Th1/Th17細(xì)胞，增加Treg細(xì)胞活性，促進(jìn)神經(jīng)元和髓鞘存活[9-11]等。本實(shí)驗(yàn)給予EAE大鼠17β-雌二醇后能延長(zhǎng)發(fā)病潛伏期，降低神經(jīng)功能評(píng)分及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，驗(yàn)證了雌激素對(duì)EAE大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。但并未改變EAE大鼠的發(fā)病率，與一些報(bào)道[12]略有差異，可能與樣本量太小，動(dòng)物種系及模型不同等因素有關(guān)。

圖1 H-E染色示腦組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn) A：模型組；B：PDTC組；C：雌激素組

圖2 免疫組織化學(xué)示NF-κB p65(ABCD)和Rho激酶(EFGH)的表達(dá) A、E：模型組；B、F：對(duì)照組；C、G：PDTC組；D、H：雌激素組

圖3 Western blot示NF-κB p65的表達(dá) a：與模型組比較，經(jīng)Bonferroni檢驗(yàn)，P＜0.01；b：與PDTC組比較，經(jīng)Bonferroni檢驗(yàn)，P＜0.05

圖4 Western blot示Rho激酶的表達(dá) a：與模型組比較，經(jīng)Bonferroni檢驗(yàn)，P＜0.01

表1 .各組NF-κB P65，Rho激酶陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

NF-κB是廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，其活性與EAE的臨床癥狀變化呈一致，NF-κB能上調(diào)TNF-α，IL-1等炎性因子和血管粘附分子(VCAM-1，ICAM-1)，調(diào)節(jié)IL-17，加重MS和EAE臨床癥狀[13]。雌激素在EAE的抗炎作用與抑制NF-κB依賴(lài)的轉(zhuǎn)錄水平有關(guān)[14]，本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)雌激素對(duì)NF-κB的抑制作用，可能是雌激素發(fā)揮抗炎作用的重要機(jī)制。

Rho激酶是軸突生長(zhǎng)抑制因子NOGO-A、MAG和OMgp的共下游底物，是抑制神經(jīng)再生的主要原因。在EAE中Rho激酶失調(diào)還可致淋巴細(xì)胞向CNS遷移，調(diào)節(jié)Th1/Th17細(xì)胞生成，破壞血腦屏障[15]；抑制Rho激酶能減少I(mǎi)L-6、IL-17等炎性因子浸潤(rùn)和髓鞘破壞[1]，說(shuō)明Rho激酶具有抗炎和神經(jīng)保護(hù)的雙重作用。本研究示雌激素能抑制Rho激酶的表達(dá)，可能是雌激素抗炎及神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制之一，但具體通過(guò)Rho激酶引起哪些功能效應(yīng)還需進(jìn)一步研究。

Hiroki等[16]發(fā)現(xiàn)在平滑肌細(xì)胞中IL-1β等炎性刺激能上調(diào)Rho激酶表達(dá)，而將NF-κB基因敲除后Rho激酶的表達(dá)降低，說(shuō)明NF-κB可調(diào)控Rho激酶的表達(dá)，但在EAE/MS中尚無(wú)相關(guān)研究。我們前期研究發(fā)現(xiàn)雌激素可通過(guò)膜表面的雌激素受體α抑制Rho激酶的表達(dá)[17]，但胞內(nèi)通路尚不詳。本實(shí)驗(yàn)在EAE大鼠給予NF-κB特異性抑制劑PDTC后，Rho激酶表達(dá)水平下降，說(shuō)明NF-κB可調(diào)控Rho激酶的表達(dá)。予以17β-雌二醇可降低NF-κB和Rho激酶的水平，提示雌激素可能部分通過(guò)抑制NF-κB而抑制Rho激酶的表達(dá)，可能是雌激素的細(xì)胞內(nèi)作用通路，但機(jī)制探討證據(jù)尚不充分，需進(jìn)一步論證。此外，本研究中雌激素干預(yù)屬預(yù)處理方式，探討MS發(fā)病后雌激素的保護(hù)作用更貼近臨床和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的要求，故尚需進(jìn)一步探討。

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