牛海峰，景鴻恩，惠 玲，閆 蔚，王 君，王宏賓，王曉臨，周 通，張國(guó)華，譚大勇

原發(fā)性肝癌是臨床最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，根據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，全世界每年新發(fā)肝癌患者約60萬(wàn)，肝癌居惡性腫瘤的第5位。除手術(shù)治療外，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是目前腫瘤治療研究的熱點(diǎn)，并有可能成為腫瘤治療的新途徑，因而尋找高效低毒的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物非常重要。鬼臼毒素主要來(lái)源于小檗科的鬼臼屬、八角蓮屬和山荷葉屬等，具有顯著的細(xì)胞毒性和抗腫瘤作用，目前臨床應(yīng)用較為廣泛的依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷(VM-26)均為半合成鬼臼毒素衍生物［1］，它們對(duì)小細(xì)胞肺癌、睪丸癌、急性白血病以及惡性淋巴腫瘤等均有良好的療效［2］。由于晚期腫瘤患者對(duì)現(xiàn)有鬼臼毒素衍生物普遍耐藥，同時(shí)該類(lèi)藥物水溶性差、抗瘤譜窄、具有較嚴(yán)重的骨髓抑制，其應(yīng)用逐漸受到限制，為克服VP-16和VM-26的不良反應(yīng)，研究者對(duì)其進(jìn)行了大量結(jié)構(gòu)修飾工作［3-4］。N-(1-烴氧基-2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基氧羰基)-L丙氨酸-4'-去甲-4-脫氧鬼臼酯(Lg-2)為本課題組新合成的一種鬼臼毒素衍生物，是以丙氨酸作為L(zhǎng)inker連接氮氧自由基生成一個(gè)新型的去甲表鬼臼酯化合物。前期研究表明，Lg-2有較好的抗腫瘤活性［5-6］。由于現(xiàn)有的鬼臼類(lèi)衍生物對(duì)肝癌的抗腫瘤活性較差，本研究以肝癌HepG-2細(xì)胞為研究對(duì)象，研究Lg-2對(duì)HepG-2細(xì)胞的抗腫瘤效果，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料 Lg-2由蘭州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院提供，相對(duì)分子量287.16，純度達(dá)95%以上，其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。DMSO配置成0.001 mol/L原液，置－20℃凍存?zhèn)溆?。HepG-2肝癌細(xì)胞株由蘭州軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科提供。RPMI 1640、DMSO、噻唑藍(lán)(MTT)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司，Hoechst33258染色試劑盒購(gòu)自碧云天公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為大連Takara公司產(chǎn)品。RT-PCR引物由大連寶生物工程有限公司合成:p53引物上游序列:5'-CGTGTGGAGTATTTGGATGACAGA-3'，下 游序 列:5'-TGTAGTGGATGGTGGTACAGTCAGA-3'。Bax引物上游序列:5'-GCCAGCAAACTGGTGCTCAA-3'，下游序列:5'-ATGTCCAGCCCATGATGGTTC-3'。Bc1-2引物上游序列:5'-TGTGTGTGGAGAGCGTCAACC-3'，下游序列:5'-TTCAGAGACAGCCAGGAGAAATC-3'。p21引物上游序列:5'-CAGGGGACAGCAGAGGAAGA-3'，下 游 序 列:5'-TTAGGGCTTCCTCTTGGAGAA-3'。Caspase3引物上游序列:5'-GACTCTGGAATATCCCTGGACAACA-3'，下 游 序 列:5'-AGGTTTGCTGCATCGACATCTG-3'。β-actin引物上游序列:5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游序列:5'-GAAGATGGTGATGGGATTC-3'。

圖1 N-(1-烴氧基-2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基氧羰基)-L 丙氨酸-4'-去甲-4-脫氧鬼臼酯(Lg-2)結(jié)構(gòu)式

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):HepG-2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)Lg-2對(duì)HepG-2細(xì)胞體外增殖的抑制作用:分別設(shè)陰性對(duì)照組(只加HepG-2細(xì)胞)、VP-16處理組及Lg-2處理組3組。在96孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔接種6000個(gè)單細(xì)胞懸液100 μl培養(yǎng)過(guò)夜，次日分別加入終濃度為 0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L的VP-16(VP-16處理組)與Lg-2(Lg-2處理組)。另設(shè)調(diào)零孔(只加培養(yǎng)液)。每組3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h;同上接種細(xì)胞于96孔板，加入終濃度為10 μmol/L的 VP-16及 Lg-2，分別培養(yǎng)12、24、36、48、60 h，在上述時(shí)間點(diǎn)吸去培養(yǎng)基，加入含5 mg/ml的 MTT 的培養(yǎng)基 100 μl，37℃ 孵育 4 h，棄上清，加入 150 μl的 DMSO，輕微震蕩 10 min，于490 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值(A)，計(jì)算增殖抑制率。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍，結(jié)果取平均值。增殖抑制率的計(jì)算公式為:

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和腫瘤細(xì)胞凋亡:分別設(shè)陰性對(duì)照組(只加HepG-2細(xì)胞)、VP-16處理組及Lg-2處理組3組。接種HepG-2細(xì)胞于培養(yǎng)瓶，每瓶1×109個(gè)，貼壁后加入終濃度為10 μmol/L的VP-16(VP-16處理組)與Lg-2(Lg-2處理組)，陰性對(duì)照組加入等量RPMI 1640，分別培養(yǎng)24、48 h，胰酶消化收集細(xì)胞，離心5 min(800 r/min)，PBS洗一次，加入預(yù)冷的70%乙醇4℃固定1 h;離心5 min(800 r/min)，棄上清，1 ml PBS重懸細(xì)胞，400目篩網(wǎng)過(guò)濾，離心棄上清，加入50 μg/ml的PI染色液，混勻，4℃避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 Hoech33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡:分別設(shè)陰性對(duì)照組(只加HepG-2細(xì)胞)及Lg-2處理組。取潔凈蓋玻片置于6孔板內(nèi)，接種2×104個(gè)HepG-2細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞達(dá)到50% ～80%融合。加入終濃度為10 μmol/L的 Lg-2(Lg-2處理組)培養(yǎng)24 h，陰性對(duì)照組加入等量 RPMI 1640，取出蓋玻片，PBS洗2次，加入0.5 ml固定液固定，棄固定液，PBS洗2遍(可輕微震蕩)，每次 3 min，加入0.5 ml的 Hoechst33258 染色液，染色5 min，PBS 洗2遍，每次3 min。加抗熒光淬滅封片液于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 p53、bax、bc1-2、p21、Caspase3 基因轉(zhuǎn)錄水平的RT-PCR檢測(cè):分組同“1.2.3”。①總 RNA 的提取:分別接種2×105個(gè)HepG-2細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中，加入終濃度為10 μmol/L的VP-16(VP-16處理組)與Lg-2(Lg-2處理組)，陰性對(duì)照組加入等量 RPMI 1640，培養(yǎng) 48 h，胰酶消化后收集，按 Invitrogen TRIZOL Reagent說(shuō)明書(shū)提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度和濃度并定量。②逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):參照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，總RNA 6 μl，DEPC 水 4.5 μl，Oligo(dT)3 μl，5 × buffer 5 μl，dNTP5 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μl，RNase inhibitor 0.5 μl。反應(yīng)條件為70℃保溫10 min，冰上2 min，42℃保溫1 h，70℃保溫15 min后冰上冷卻。③PCR:β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參，反應(yīng)體系為 20 μl，其中cDNA 2 μl，上下游引物各 0.8 μl，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2 × )10 μl，ROX Reference Dye(50 × )0.4 μl，ddH2O 6 μl。擴(kuò)增條件為 95℃ 預(yù)變性 30 s，95℃ 5 s，60℃ 31 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。通過(guò) qPCR檢測(cè)細(xì)胞樣品中的目的基因和內(nèi)參基因的表達(dá)量，根據(jù)qPCR反應(yīng)曲線得到各樣品目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，采用ΔΔCt的方法進(jìn)行相對(duì)定量。

ΔΔCt=(待測(cè)樣本的目的基因的Ct平均值－待測(cè)樣本的內(nèi)參基因的Ct平均值)－(對(duì)照樣本的目的基因的Ct平均值－對(duì)照樣本的內(nèi)參基因的Ct平均值)。

基因的表達(dá)量用F=2－ΔΔCt來(lái)表示，內(nèi)參基因Ct值及目的基因Ct值均取3次實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 Lg-2對(duì)HepG-2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，Lg-2對(duì)HepG-2細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用。藥物處理48 h，隨藥物濃度增加抑制效應(yīng)增強(qiáng)，Lg-2處理組各濃度HepG-2抑制率均高于VP-16處理組(P＜0.05)，見(jiàn)表1。隨藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)抑制效應(yīng)增強(qiáng)，Lg-2處理組各作用時(shí)間HepG-2抑制率均高于VP-16處理組(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

表1 不同濃度VP-16、Lg-2對(duì)HepG-2細(xì)胞抑制率比較(±s，%)

表1 不同濃度VP-16、Lg-2對(duì)HepG-2細(xì)胞抑制率比較(±s，%)

注:VP-16:依托泊苷，Lg-2:N-(1-烴氧基-2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基氧羰基)-L丙氨酸-4'-去甲-4-脫氧鬼臼酯;與VP-16處理組相同藥物濃度比較，aP＜0.05

藥物濃度(μmol/L)VP-16處理組(n=3)Lg-2處理組(n=3)0.001 11.533 ±1.401 17.867 ±1.795a 0.01 21.367 ±1.332 26.467 ±0.850a 0.1 23.367 ±1.172 29.700 ±1.453a 1 31.633 ±1.124 47.533 ±1.514a 10 41.033 ±1.430 55.100 ±2.663a

表2 VP-16、Lg-2不同作用時(shí)間對(duì)HepG-2抑制率的影響(±s，%)

表2 VP-16、Lg-2不同作用時(shí)間對(duì)HepG-2抑制率的影響(±s，%)

注:VP-16:依托泊苷，Lg-2:N-(1-烴氧基-2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基氧羰基)-L丙氨酸-4'-去甲-4-脫氧鬼臼酯;與VP-16處理組相同作用時(shí)間比較，aP＜0.05

作用時(shí)間(h)VP-16處理組(n=3)Lg-2處理組(n=3)12 25.431 ±0.994 33.932 ±1.854a 24 42.532 ±1.866 47.474 ±0.652a 36 50.801 ±1.478 58.034 ±1.223a 48 54.174 ±1.821 59.631 ±2.061a 60 66.000 ±1.413 72.572 ±2.956a

2.2 Lg-2對(duì)HepG-2細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，在24及48 h時(shí)，Lg-2處理組S期細(xì)胞所占比例與陰性對(duì)照組及VP-16處理組比較均明顯增加，而G2/M期細(xì)胞顯著減少，提示Lg-2可使細(xì)胞阻滯在G2/M期，見(jiàn)表3。

表3 Lg-2對(duì)HepG-2細(xì)胞周期分布的影響(%)

2.3 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化 Hoechst33258染色顯示，Lg-2處理組細(xì)胞核呈現(xiàn)不同程度的早期凋亡特征，如染色質(zhì)致密濃縮，胞核體積變小，形狀變?yōu)槟I型核，或細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體，典型的呈梅花瓣?duì)?而陰性對(duì)照組細(xì)胞細(xì)胞核完整，染色質(zhì)均勻，無(wú)凋亡特征。見(jiàn)圖2。

圖2 Hoechst33258檢測(cè)Lg-2對(duì)HepG-2細(xì)胞凋亡的影響

2.4 Lg-2對(duì)HepG-2細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與VP-16處理組比較，Lg-2處理組Bc1-2 mRNA的表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，而 p53、Bax、p21、Caspase-3 mRNA 的表達(dá)顯著增高(P＜0.05)，見(jiàn)表4。

表4 Lg-2對(duì)HepG-2細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討論

鬼臼毒素類(lèi)藥物如VP-16是細(xì)胞周期依賴(lài)性和特異性抗腫瘤藥物，主要通過(guò)作用于DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(topoisomeraseⅡ)使DNA斷鏈而產(chǎn)生抗腫瘤作用［7］。筆者所在課題組以鬼臼毒素為基礎(chǔ)，合成了一系列結(jié)構(gòu)新穎且具有較好抗腫瘤活性的鬼臼毒素衍生物。其中Lg-2是以丙氨酸作為L(zhǎng)inker連接氮氧自由基生成一個(gè)新型的去甲表鬼臼酯化合物，有文獻(xiàn)報(bào)道，該基團(tuán)本身具有一定抗腫瘤作用，并可作為抗腫瘤藥物載體使其優(yōu)先聚積在腫瘤組織中［8］。本研究結(jié)果顯示，Lg-2能夠有效抑制人肝癌細(xì)胞系HepG-2的增殖，MTT檢測(cè)結(jié)果顯示Lg-2對(duì)HepG-2的作用呈時(shí)間依賴(lài)及劑量依賴(lài)性。Lg-2處理的HepG-2細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析其周期變化，G2/M期細(xì)胞比例顯著減少，提示Lg-2可使細(xì)胞阻滯在G2/M期，這與VP-16引起細(xì)胞周期S期阻滯有所不同，提示Lg-2可能具有其他的作用靶點(diǎn)。qRT-PCR結(jié)果顯示，與VP-16處理組比較，Lg-2處理組 Bc1-2 mRNA的表達(dá)顯著降低，而 p53、Bax、p21、Caspase-3 mRNA的表達(dá)顯著增高。

細(xì)胞凋亡受多種凋亡相關(guān)基因調(diào)控［9］，目前研究較為深入的與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的凋亡相關(guān)基因主要有p53基因、Caspase基因、Bcl-2基因家族等。近年來(lái)的研究表明，許多抗癌藥物通過(guò)誘導(dǎo)凋亡基因(如p53、Bax等)的表達(dá)，以及影響凋亡抑制基因(如 Bcl-2)的表達(dá)，達(dá)到抑制腫瘤增殖的作用［10］。p53 基因是一種腫瘤抑制基因［11］，分為野生型(wtp53)和突變型(mtp53)兩種［12］。野生型 p53基因可抑制細(xì)胞的異常增殖，能在細(xì)胞發(fā)生DNA損傷時(shí)使細(xì)胞停滯于G1/S期，使細(xì)胞有足夠時(shí)間修復(fù)損傷的DNA，恢復(fù)正常狀態(tài);若損傷的DNA無(wú)法修復(fù)，則野生型p53基因可啟動(dòng)細(xì)胞凋亡機(jī)制。p53可以上調(diào)Bax的表達(dá)、下調(diào)Bc1-2的表達(dá)共同完成促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。Bcl-2基因是重要的抗細(xì)胞凋亡的調(diào)控因子，是Bcl基因家族的一個(gè)重要成員，是一種調(diào)控細(xì)胞死亡的“存活基因”［13］。Bcl-2可抑制細(xì)胞的程序性死亡，并提供了一個(gè)選擇性的生存優(yōu)勢(shì)。Bc1-2蛋白具有離子通道和?？康鞍椎碾p重作用，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜、線粒體膜上，它可以嵌入到膜中，將Bcl-2固定在膜上。目前認(rèn)為，Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與凋亡促進(jìn)基因Bax拮抗，抑制細(xì)胞色素C自線粒體釋放到胞質(zhì)，阻止細(xì)胞色素C對(duì)Caspase蛋白酶激活有關(guān)。Bcl-2還能促進(jìn)谷胱甘肽進(jìn)入細(xì)胞核，從而改變核內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，阻止Caspase蛋白酶的活動(dòng)和其他核改變，抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生［14］。p21基因是野生型p53基因的下游基因，在p21基因上游有2個(gè)p53蛋白特殊序列結(jié)合位點(diǎn)，分別位于2400和8000 bp處。大量研究報(bào)道顯示p21有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，當(dāng)DNA受到損傷時(shí)，p21通過(guò)p53依賴(lài)性途徑修復(fù)受損的DNA，當(dāng)修復(fù)失敗時(shí)，p53則介導(dǎo)受損細(xì)胞凋亡［15］。因此p21基因通過(guò)p53依賴(lài)性途徑間接參與了細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HepG-2細(xì)胞經(jīng)Lg-2處理后，p53轉(zhuǎn)錄水平增加，Bc1-2基因表達(dá)降低，Bax基因表達(dá)增強(qiáng)，使得Bax/Bcl-2上調(diào)，誘導(dǎo)凋亡。此外，Lg-2激活p21的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞內(nèi)所發(fā)生的與凋亡有關(guān)的一系列有序的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，Caspase蛋白水解酶的激活是關(guān)鍵步驟，Caspase-3是Caspase家族成員中執(zhí)行凋亡的關(guān)鍵酶之一，在各種類(lèi)型的細(xì)胞中廣泛分布，處于凋亡有序級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，在細(xì)胞內(nèi)以無(wú)活性的前體(酶原)形式存在，被細(xì)胞外凋亡信號(hào)激活后，負(fù)責(zé)對(duì)全部或部分關(guān)鍵性蛋白的酶切(激活或滅活)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［16］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用HepG-2細(xì)胞經(jīng) Lg-2后 Caspase-3 mRNA的水平上升，說(shuō)明 Lg-2可能通過(guò)上調(diào)Caspase-3 mRNA水平來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［17］。

綜上所述，Lg-2可能通過(guò)使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期抑制細(xì)胞增殖，并通過(guò)p53、p21、Caspase-3信號(hào)途徑誘導(dǎo)其凋亡達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。本研究為開(kāi)發(fā)新的肝癌輔助用藥提供了理論依據(jù)，將有利于指導(dǎo)相關(guān)臨床前研究的開(kāi)展。

［1］Brene S，Bjonebekk A，Aberg E，et al.Running is rewarding and antidepressive［J］.Physiol Behav，2007，92(1/2):136.

［2］呂晶晶，張予陽(yáng)，陳虹，等.鬼臼毒素衍生物CIP-36誘導(dǎo)KBV200細(xì)胞凋亡［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(5):607.

［3］許重遠(yuǎn)，賈江濱.4'-去甲表鬼白毒素衍生物4β-取代結(jié)構(gòu)修飾研究進(jìn)展［J］.中草藥，2000，31(5):389-392.

［4］萬(wàn)宗明，陳虹，曹鴻，等.黃酸鬼白毒素酯對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞作用機(jī)制的研究［J］.中草藥，2008，39(1):67-71.

［5］Dinsdale D，Lee J C，Dewson G，et al.Intermediate filaments control the intracellular distribution of caspases during apoptosis［J］.Am J Pathol，2004(164):395-407.

［6］揚(yáng)樺，田暄，張輔民.4-β-盧代芳香酸4'去甲表鬼臼酯類(lèi)的合成及抗腫瘤活性［J］.蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2004，38(2):101-105.

［7］Chen M C，Pan S L，Shi Q，et al.QS-ZYX-1-61 induces apoptosis through topoisomeraseⅡin human non-smallcell lung cancer A549 cells［J］.Cancer Sci，2012，103(1):80-87.

［8］張曉文，賈正平，孟富敏，等.4-［4"(2"，2"，6"，6"-四甲基哌啶氮氧自由基)氨基］4'-去甲表鬼臼毒與其自由基還原物的抗腫瘤作用比較［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，1997，13(1):28-30.

［9］宋娜，金波，劉云鵬，等.非小細(xì)胞肺癌組織COX-2和p53表達(dá)及臨床意義的研究［J］.中華腫瘤防治雜志，2008，15(16):1247-1250.

［10］Heath Engel H M，Wang B，Shore G C，et al.Bcl2 at the endoplasmic reticulum protects against a Bax/Bak-independent paraptosis like cell death pathway initiated via p20Bap31［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1823(2):335-347.

［11］Kim J S，Kim J W，Han J，et al.Cohypemethylation of p16 and FHIT promoters as a prognostic factor of recurrence in surgically resected stageⅠnon small cell lung cancer［J］.Cancer Res，2006，66(8):4049-4054.

［12］何靜華，李勝水，許華，等.結(jié)腸癌中ILK及p53的表達(dá)情況及其預(yù)后意義［J］.中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2013，20(7):9-10.

［13］Gonzalez Rodilla I，Verna V，Muoz A B，et al.Expression of the apoptosis-related genes Bcl-2 and P53 in clinical samples from endometrial carcinoma patients［J］.Anticancer Res，2011，31(12):4191-4193.

［14］程向東，杜義安，黃靈，等.苦參堿在調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡中的作用［J］.中國(guó)腫瘤臨床，2008，35(12):711-713.

［15］Spierings D C J，de Vries E G E，Stel A J，et al.Low P21(Wafl/Cipl)protein level sensitizes testicular germ cell tumor cells to Fas-mediated apoptosis［J］.Oncogene，2004，23(28):4862-4872.

［16］Lakhani S，Masud A，Kuida K，et al.Caspases3 and 7:key mediators of mitochondrial events of apoptosis［J］.Science，2006，311(5762):847-851.

［17］Lavrik I N.Systems biology of apoptosis signaling networks［J］.Curt Opin Biotechnol，2010，21(4):551-555.