離子液體雙水相體系及其在蛋白分離中的應(yīng)用

劉曉庚 高 梅 陳梅梅

(南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院1，南京 210046)

(江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點實驗室2，南京 210046)

(南京財經(jīng)大學圖書館室3，南京 210046)

離子液體是近十年來迅速發(fā)展起來的一種全新綠色介質(zhì)和功能材料。離子液體具有不易揮發(fā)、不可燃、穩(wěn)定性高、溶解能力強、功能可調(diào)節(jié)等優(yōu)點，其應(yīng)用領(lǐng)域正不斷地擴大，從開始的化學合成發(fā)展到今天的材料科學、環(huán)境科學、工程技術(shù)、分析測試、生物催化等領(lǐng)域，其獨特的性質(zhì)和廣泛的應(yīng)用前景使其迅速發(fā)展起來［1－3］。離子液體在萃取分離生物物質(zhì)方面表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，已有不少文獻報道了離子液體可形成雙水相體系［4］，這無疑會開拓一種新的綠色分離技術(shù)。離子液體具有一般離子溶液所沒有的獨特性能，如不揮發(fā)性、熱力學穩(wěn)定性和強溶解性等的特點，這些特點不僅拓寬了離子液體的應(yīng)用范圍，而且為尋找一種更為高效、綠色的生物分離技術(shù)提供了依據(jù)［5］，使其在生物活性物質(zhì)的分離上展現(xiàn)了十分誘人的應(yīng)用前景。

1 離子液體雙水相的研究

離子液體雙水相體系(Ionic liquids aqueous two－phase system，ILATPS)一般是由親水性離子液體、無機鹽(如磷酸鹽、碳酸鹽、氫氧化物等)和水形成的雙水相體系，它綜合了離子液體和雙水相體系的優(yōu)點［6］。作為一種高效的新型綠色分離體系，與傳統(tǒng)聚合物雙水相體系相比，離子液體雙水相具有黏度低、分相快、不易乳化、萃取率高、離子液體可以循環(huán)利用等優(yōu)點，因此越來越受到學術(shù)界及產(chǎn)業(yè)界的重視［7］。

1.1 離子液體雙水相體系的類型

ILATPS的形成是 2002年 Dupont等［8］在用 C4mimCl和KBF4合成離子液體C4mimBF4時首次發(fā)現(xiàn)由于鹽析效應(yīng)在KCl存在下使C4mimBF4和水形成兩相的現(xiàn)象。Gutowski等［9］2003年首次提出了ILATPS的概念，并研究了親水性離子液體［C4mim］Cl(氯化1－丁基－3－甲基咪唑)與K3PO4能夠形成上相富集離子液體和下相富集磷酸鉀的雙水相體系，同時預(yù)言了該體系在萃取分離上有極好的應(yīng)用前景。此后，離子液體形成雙水相新體系及其應(yīng)用的報道如雨后春筍層出不窮(表1)，但仍以磷酸鹽類的成相效果最好且應(yīng)用最廣。另外，陳玉煥等［10］發(fā)現(xiàn)親水性離子液體［Bmim］BF4和糖也可以形成雙水相體系。

1.2 幾種典型離子液體雙水相體系的特點及應(yīng)用概況

雙水相體系的主要類型有:高聚物/高聚物、高聚物/無機鹽、親水有機物/鹽體系等［7］。近年來該技術(shù)又有了新的發(fā)展，出現(xiàn)了ILATPS。人們對該體系也做了相應(yīng)的嘗試性研究，其中研究比較多的是離子液體/鹽體系。據(jù)與離子液體形成雙水相體系的對象不同可以將其分為如表2所示的3種類型。

表1 離子液體/鹽雙水相體系的主要類型

表2 離子液體雙水相主要類型及特點

離子液體－無機鹽雙水相體系的分相過程實質(zhì)上是一個無機鹽與離子液體競爭奪取水分子的過程，其分相能力與離子液體的水化能力和無機鹽的鹽析能力密切相關(guān)，離子液體的水化能力越大分相能力越差，而無機鹽的鹽析能力越大其分相能力越強［11］。

1.3 近年來離子液體雙水相的文獻統(tǒng)計分析與研究發(fā)展趨勢

有關(guān)ILATPS的文獻是在2012年2月分別在《中國知網(wǎng)》和《Elsevier》數(shù)據(jù)庫中以“離子液體雙水相”及“Ionic liquids aqueous two－phase”為題名檢索所得。這些文獻反映了國內(nèi)外2012年以前ILATPS研究的主要成就，其內(nèi)容包括綜合論述、基礎(chǔ)研究及萃取分離分析研究等。

離子液體雙水相的研究主要是從近幾年開始的，剔除非學術(shù)性論文，共收集2005年以來有關(guān)離子液體雙水相的期刊文獻共65篇，其中外文文獻21篇，年平均文獻量為10.8篇(表3)。國內(nèi)外關(guān)于ILATPS的研究文獻是從2005年才見報道，且2010年以來發(fā)展迅猛，共有35篇，占總文獻的53.85%。ILATPS的文獻主要研究方向為萃取分離分析，占總文獻的73.85%。刊載ILATPS研究論文文獻的刊物達50種，且以化學工業(yè)類刊物居多，占期刊總數(shù)的70%以上。

表3 離子液體雙水相文獻統(tǒng)計分布

由表3看出，分離分析研究在ILATPS研究中占據(jù)主要地位，且在整個檢索的年段間，ILATPS研究內(nèi)容也側(cè)重于萃取分離分析研究。在萃取分離研究中，側(cè)重于對蛋白質(zhì)［19］、氨基酸［20］、糖類［15］等生物活性物質(zhì)的萃取分離，尤其是對藥物中的生物活性成分物質(zhì)的萃取分離研究和藥物活性成分的殘留分析研究更為突出。原因是ILATPS具有分相時間短、黏度低、萃取過程不易乳化、萃取率高、分離條件溫和、對生物活性物質(zhì)钚破壞且離子體系可以且易回收利用等優(yōu)點，因此，離子液體雙水相這一新的萃取分離體系，開辟了生物分離工程的應(yīng)用新天地。

2 離子液體雙水相萃取分離蛋白質(zhì)的研究

2.1 離子液體雙水相體系的成相機理

離子液體雙水相主要由離子液體、輔助鹽和水3種組分構(gòu)成。從相的組成及其相互作用的角度影響ILATPS形成的主要原因包括鹽析效應(yīng)、疏水相互作用、靜電作用及氫鍵等。

2.1.1 鹽析效應(yīng)影響

作為雙水相體系的重要組成部分，無機鹽的性質(zhì)對雙水相體系的相平衡具有重要的影響。Gutowski等［9］和 Collins［21］認為這種現(xiàn)象是由于憎溶劑效應(yīng)所致。輔助鹽可能起著非特征性的鹽析作用，以滲透壓作用推動雙水相的形成。Gutowski等［9］研究認為，形成離子液體雙水相的主要原因是K3PO4的鹽析效應(yīng)。鹽的水合自由能(ΔG水合)是控制離子液體和K3PO4的分相效率的主要因素，該研究小組將離子液體雙水相的成相機理解釋為:由于PO43－離子的存在，使其周圍水分子處于電子壓縮狀態(tài)，這樣就增強了富鹽相中水分子之間的氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。因此，要想形成較大的容納離子液體陽離子［C4mim］+的水分子空腔就需要更大的能量，當PO43－的濃度達到一定程度時，體系就會出現(xiàn)較多的疏水性離子液體陽離子和較少的水合Cl－離子單獨形成一相，這個機理和聚乙二醇－鹽體系的成相機理一致［22］。Trindade等［23］通過研究無機鹽 NaCl、Na2SO4和 Na3PO4與離子液體［C4mim］BF4的成相行為，結(jié)果表明這3種無機鹽與離子液體均是通過鹽析效應(yīng)使體系形成互不相溶的兩相，且無機鹽鹽析效應(yīng)的能力取決于離子強度(I)及無機鹽水合自由能(ΔG水合)的大小。

2.1.2 疏水相互作用

離子液體分子可看成是由疏水和親水兩部分組成。疏水部分在水溶液中聚集成核，親水部分向外張開形成膠束。熱力學研究表明，疏水相互作用是離子液體雙水相體系形成的主要驅(qū)動力［24］。在離子液體與水的混合體系中，其主導(dǎo)的作用是陰離子與水分子之間的相互作用，在陰離子周圍的水分子力學遠大于陽離子周圍的水分子，也就是說，對于離子液體和水的混合體系，陰離子與水之間的相互作用遠大于陽離子與水之間的相互作用，即陰離子與水之間的相互作用占主導(dǎo)地位［25］。而由于離子液體中陽離子的體積較大，導(dǎo)致陰陽離子間的相互作用減弱，離子液體在水中主要以分隔離子對的形態(tài)存在，頭部的疏水作用會改變陰離子與頭部間的作用力，增加離子液體內(nèi)部的凝聚性形成較大尺寸的膠束，從而引發(fā)相區(qū)分隔和有序分子聚集體的形成，進而形成雙水相(圖1)。聚集行為發(fā)生時，因疏水作用相結(jié)合的離子液體分子的脫落，導(dǎo)致了體系熵增加(ΔS＞0)，而自由能減小(ΔG ＜0)，因而這成為聚集體形成的直接驅(qū)動力。

2.1.3 氫鍵作用

離子液體雙水相形成的另一個重要的作用是氫鍵，離子液體中的氮雜環(huán)與水可以形成N－H…NH、N－H…O－H等氫鍵網(wǎng)絡(luò)。這樣一個在親水極性區(qū)形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以增加離子液體陽離子頭基的親水性，使其在極性區(qū)穩(wěn)定地存在，從而使離子液體具有合適的兩親性質(zhì)，促進層狀相溶致液晶的形成［26］。另外，由咪唑環(huán)引起的π－π相互作用也可以促進分子層狀排列［27］，有利于形成層狀相溶致液晶。如咪唑環(huán)上的3個質(zhì)子均能和水分子形成穩(wěn)定的氫鍵作用，這些作用的相互結(jié)合與促進就導(dǎo)致了此體系在很寬的濃度范圍內(nèi)形成有序的層狀相溶致液晶［25］。

2.1.4 熱力學解釋

另外，劉慶芬等［28］研究表明高溫不利于短鏈離子液體雙水相的形成。但高溫有利于長鏈離子液體雙水相的分離，這與離子表面活性劑鹽溶液形成長條膠團的性質(zhì)非常接近［29］，說明長鏈離子液體主要依靠焓變(ΔH)來實現(xiàn)相分離。相分離發(fā)生的本質(zhì)在于同組分間比不同組分間具有更強的引力相互作用，而該相互作用可通過某組分的相互作用焓變和相互作用熵變作出定性解釋，相分離時相互作用熵變表現(xiàn)為吸引相互作用，是導(dǎo)致高溫相分離的重要因素，而相互作用焓變則表現(xiàn)為斥力相互作用，它將導(dǎo)致體系具有很好的低溫混溶效果［30］。

2.2 離子液體雙水相萃取蛋白質(zhì)機理

離子液體雙水相萃取分離蛋白質(zhì)屬于液－液萃取，其原理與水－有機相萃取的原理相似。當?shù)鞍踪|(zhì)進入雙水相體系后，由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種力(如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等)的作用和溶液環(huán)境的影響，使其在上、下相中的濃度不同，即各成分在兩相間的選擇性分配，從而達到萃取分離的目的。蛋白質(zhì)與離子液體作用，主要有鹽析作用;與輔助萃取劑發(fā)生配位作用生成配合物，配合物被萃取到離子液體中;或者調(diào)節(jié)pH，使蛋白質(zhì)的疏水基團暴露出來，從而萃取到離子液體中等。

Tani等［31］研究發(fā)現(xiàn)血紅素蛋白(細胞色素C)在合適的輔助萃取劑存在下，生成的配合物可被萃取到離子液體中。用冠醚(DCH18C6)為萃取劑，以離子液體C2OHmimTf2N為溶劑，發(fā)現(xiàn)血紅蛋白(細胞色素C)與DCH18C6發(fā)生配位作用，實現(xiàn)了離子液體對細胞色素C的萃取，從而實現(xiàn)了細胞色素C在合適輔助萃取劑下用離子液體雙水相進行分離純化的目標。由Du等［32］用離子液體BmimCl與KH2PO4組成的雙水相體系對牛血清蛋白進行的進一步萃取分離研究，結(jié)果表明牛血清蛋白被萃取到離子液體相中的主要機理就是鹽析效應(yīng)，離子液體與蛋白質(zhì)本身并沒有發(fā)生化學作用。

通過熱力學研究表明，雖然靜電相互作用［33］和鹽析作用是蛋白質(zhì)在雙水相中轉(zhuǎn)移的力量，但疏水相互作用是其主要驅(qū)動力［34］。蛋白質(zhì)中的疏水側(cè)鏈殘基一直被認為是蛋白質(zhì)的活性位點，參與和其他分子的相互作用，這樣而產(chǎn)生的疏水相互作用可以引起疏水鏈進入到離子液體的疏水區(qū)，水、離子液體和蛋白質(zhì)的羧酸根在親水區(qū)分別進行聚集，從而引發(fā)相區(qū)分隔和蛋白質(zhì)分子的轉(zhuǎn)移。程德紅［35］研究表明在酸性條件下，細胞色素C構(gòu)型發(fā)生轉(zhuǎn)變，疏水性基團暴露出來，促使細胞色素C被萃取到離子液體中;當溶液pH＜2時，細胞色素C中血紅素基團的鐵原子與甲硫氨酸的第6個配位鍵斷裂，提供一個空的配位位置，與離子液體的咪唑陽離子發(fā)生配位作用，從而促使細胞色素C進入離子液體中。王鍵吉等［36］測定了［C4mim］Br/K2HPO4體系中氨基酸側(cè)鏈上的亞甲基從富鹽相到富離子液體相的轉(zhuǎn)移自由能(ΔGCH2)。結(jié)果表明，此時，當ΔGCH2＜0，說明富離子液體相的疏水性比富鹽相要強。隨著系線長度的增長，ΔGCH2值降低，所以當氨基酸在兩相間分配時，更容易轉(zhuǎn)移到富離子液體相，它的分配系數(shù)也逐漸增大。

另一個重要的作用是氫鍵相互作用，不僅離子液體中的氮雜環(huán)和蛋白質(zhì)可以形成氫鍵，水與離子液體、蛋白質(zhì)也均可以形成氫鍵網(wǎng)絡(luò)。這樣一個在親水極性區(qū)形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以增加蛋白質(zhì)的親水性，使其在極性區(qū)穩(wěn)定地存在，從而促進蛋白質(zhì)在兩相間的轉(zhuǎn)移。

2.3 離子液體雙水相萃取分離蛋白質(zhì)的實例

離子液體/鹽雙水相萃取技術(shù)是雙水相萃取技術(shù)一個新的分支，它具有傳統(tǒng)雙水相技術(shù)所不具備的諸多優(yōu)點，如操作簡單、無污染、分離效率高、可控制乳化、可循環(huán)使用離子液體等［37］。離子液體雙水相萃取技術(shù)在蛋白質(zhì)分離純化領(lǐng)域研究和應(yīng)用發(fā)展較快?，F(xiàn)將近年來國內(nèi)外離子液體雙水相萃取分離蛋白質(zhì)/酶的研究列于表4。

表4 離子液體雙水相萃取分離蛋白質(zhì)的幾個應(yīng)用實例

從表4的應(yīng)用實例表明，離子液體雙水相萃取在分離純化蛋白質(zhì)方面日新月異、日臻致善，發(fā)展迅速，而與其它方法相比，具有高效、環(huán)保且維持其生物活性的特強等優(yōu)勢，特別適合生物活性物質(zhì)的分離，為分離純化蛋白質(zhì)開辟了一個嶄新天地。

3 結(jié)束語

ILATPS用于萃取分離方面的研究還處于研究與工業(yè)應(yīng)用的起步階段，雖然目前已有一些研究應(yīng)用的報道，但人們對分離體系中各組分在ILATPS中與離子液體的相互作用、各組分的分配情況及其機理的了解還不深入和全面，因此迫切需要對ILATPS萃取分離方面進行系統(tǒng)的理論和應(yīng)用研究，使之形成完善的體系。同時，離子液體使用對環(huán)境和生態(tài)的安全性，以及殘留測定及對人類的危害等安全性問題都有待深入研究;另外，開發(fā)出具有特殊功能的離子液體，提高和改善離子液體自身的性能以滿足特定的分離技術(shù)要求，同時ILATPS中各組分的回收利用等問題也值得進一步完善。

以離子液體作為萃取溶劑進行萃取分離可以減少有機溶劑帶來的環(huán)境污染及對操作人員的危害，因此，用離子液體替代傳統(tǒng)的有機溶劑用于生命物質(zhì)中DNA、蛋白質(zhì)、酶等活性物質(zhì)的分離是重點發(fā)展方向，同時，離子液體在分離技術(shù)環(huán)保和能源領(lǐng)域的煤炭脫硫、石油加工、新型鋰電池的改進等方面都在發(fā)揮著異軍突起的獨到作用。相信隨著離子液體研究的深入，離子液體的分離技術(shù)必將越來越成熟，也使ILATPS日漸改善，為社會主義建設(shè)發(fā)揮更大作用。

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