胡 曦 予，崔 勵，馮 魁

(大連工業(yè)大學(xué) 輕工與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

0 引 言

甾體類藥物是僅次于抗生素的第二大類藥物，隨著需求量的不斷增大，合成甾體類藥物的反應(yīng)技術(shù)得到越來越廣泛和深入的研究[1]。與傳統(tǒng)化學(xué)合成方法相比，微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)污染低、能耗低、特異性高，且具有轉(zhuǎn)化步驟簡單、轉(zhuǎn)化類型豐富等諸多優(yōu)點[2]，因此人們逐漸將目光投向甾體微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)。

雄甾－4－烯－3，17－二酮是制造甾體激素類藥物的關(guān)鍵中間體，在其甾體母核上引入羥基，可使其抗炎活性大大增強。經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得的11α－羥基雄甾－4－烯－3，17－二酮是制備用于治療高血壓及充血性心力衰竭的新型藥物的關(guān)鍵中間體，臨床療效優(yōu)于同類藥物[3－4]。

目前，關(guān)于微生物法轉(zhuǎn)化甾體藥物的新菌種及新技術(shù)研究發(fā)展態(tài)勢良好。國內(nèi)外研究工作主要集中在甾醇制備雄甾－4－烯－3，17－二酮，以及運用赭曲霉及綠僵菌等菌種催化黃體酮，關(guān)于黑根霉催化合成11α－羥基雄甾－4－烯－3，17－二酮的內(nèi)容鮮有報道[5－6]。

本文采用微生物轉(zhuǎn)化法，以黑根霉RN－M246為實驗菌種，雄甾－4－烯－3，17－二酮為底物，合成11α－羥基雄甾－4－烯－3，17－二酮，考察并優(yōu)化11α－羥基化反應(yīng)條件，提高產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率，為11α－羥基雄甾－4－烯－3，17－二酮的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

黑根霉RN－M246，清華大學(xué)生命科學(xué)院提供；雄甾－4－烯－3，17－二酮，11α－羥基 雄甾－4－烯－3，17－二酮，購自Sigma公司；其余各試劑均為分析純，市售。

斜面培養(yǎng)基：小米培養(yǎng)基，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g／L)：葡萄糖30，蛋白胨20，冷榨豆粉10，檸檬酸三銨1，磷酸氫二鉀5，pH 5.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備

黑根霉斜面中加適量無菌水，將孢子洗下，紗布過濾，充分振蕩，制成107～108個／mL孢子懸液。

1.2.2 搖瓶轉(zhuǎn)化工藝

在500mL搖瓶中加入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，接入4%的菌懸液，28℃、160r／min培養(yǎng)24h，其后加入10mmol／L的底物并提高轉(zhuǎn)速至220r／min繼續(xù)轉(zhuǎn)化48h。

1.2.3 菌體干重的測定

抽濾發(fā)酵液，分離菌絲體及轉(zhuǎn)化液，并將菌體用去離子水洗滌3次，放入80℃烘箱內(nèi)烘干至恒重。

1.2.4 分析方法

將發(fā)酵液高速離心，取上清液用甲醇稀釋，將稀釋液用0.45μm有機濾膜過濾，作為檢測樣品，運用HPLC測定分析。色譜條件：C18烷基硅烷鍵合反相柱；流動相甲醇－水的體積比為3∶2；體積流量0.8mL／min；色譜柱溫25℃；紫外檢測器波長242nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 底物投料時間對產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率的影響

為確定底物投料的最佳時間，分別在反應(yīng)開始以及菌體生長6、12、18、24、30、36h后投放10mmol／L的雄甾－4－烯－3，17－二酮，投放48h后考察其轉(zhuǎn)化情況。

如圖1所示，菌體發(fā)酵的前24h投料比其后投料效果好，并且在反應(yīng)開始時投料轉(zhuǎn)化率最高。分析其原因認為，雖然甾體對微生物具有毒性，但在底物添加量較少時，毒性抑制作用也很小。在菌體未成熟前，菌體不纏繞，較分散，此時添加少量底物，底物與菌體接觸面積較大，更易充分接觸，從而誘導(dǎo)更多利于底物進行11α－羥基化的酶生成，因此轉(zhuǎn)化率高于菌體成熟后再添加底物。由此判斷，反應(yīng)開始時為添加底物的最佳時間。

圖1 底物投料時間對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.1 Effect of feeding time on the conversion rate

2.2 發(fā)酵時間對產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率的影響

將底物與培養(yǎng)基一起滅菌后接種發(fā)酵，分別間隔12h檢測轉(zhuǎn)化率。通過不同的取樣時間考察發(fā)酵過程，確定最佳的發(fā)酵時間。

如圖2所示，發(fā)酵時間在12～48h，底物迅速轉(zhuǎn)化，其后轉(zhuǎn)化率增長緩慢，72h后轉(zhuǎn)化率幾乎不再提高，且可觀察到菌體形態(tài)在72h后逐漸變得細碎。推測原因為發(fā)酵時間較長，培養(yǎng)基中菌體生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)變少，導(dǎo)致菌體不再生長甚至開始自溶，酶活力降低。因而發(fā)酵最佳時間為72h。

圖2 發(fā)酵時間對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the conversion rate

2.3 接種量對產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率的影響

接種量是決定菌體量、菌體形態(tài)及轉(zhuǎn)化體系的重要因素之一。因而分別考察接入體積分數(shù)為2%、3%、4%、5%、6%、8%的菌懸液對轉(zhuǎn)化率的影響。

由圖3可知，接種量越大，菌絲體生長得越多，但接種量較多不利于轉(zhuǎn)化。當接種量為4%時，轉(zhuǎn)化率較高，因而選用4%為最佳接種量。

2.4 裝液量對產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率的影響

黑根霉為好氧菌，且羥基化作用中的氧來自于空氣[7]，適當?shù)娜苎趿坎粌H有利于菌體的生長，同時也促進羥基化反應(yīng)的順利進行，因而溶氧量是重要的考察因素。裝液量在一定程度上與溶氧量相關(guān)，可通過裝液量考察溶氧對發(fā)酵或生物轉(zhuǎn)化的影響。本實驗選用500mL搖瓶，分別考察裝液量為25、50、75、100、125mL時對轉(zhuǎn)化率的影響。

圖3 接種量對轉(zhuǎn)化率及菌體干重的影響Fig.3 Effect of inoculum concentration on the conversion rate and mycelium dry weight

溶氧量與菌體的生長發(fā)育、代謝途徑以及產(chǎn)物形成密切相關(guān)。如圖4所示，當裝液量較低時轉(zhuǎn)化率低，當裝液量提高到75mL時，溶氧量較適宜，轉(zhuǎn)化率最高可達47.5%，因而選用75mL為最佳裝液量。

圖4 裝液量對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of volume of culture medium on the conversion rate

2.5 轉(zhuǎn)化溫度對產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率的影響

在生物轉(zhuǎn)化過程中需要充足的菌體和酶，因而，菌體在28℃條件下生長24h后，在保證菌體量及酶的高活性的前提下，改變轉(zhuǎn)化溫度，考察轉(zhuǎn)化過程最適宜的溫度。由圖5可見，在菌體生長較為成熟且轉(zhuǎn)化仍迅速進行的24h時改變溫度，發(fā)現(xiàn)溫度小于28℃時轉(zhuǎn)化率較低，轉(zhuǎn)化率隨著溫度升高而升高，28℃時轉(zhuǎn)化率達到最高，大于28℃后轉(zhuǎn)化率略有下降。推測可能溫度過高和過低對菌體生長或產(chǎn)相關(guān)酶不利，也可能使11α－羥基化酶活性降低。對于黑根霉催化雄甾－4－烯－3，17－二酮的11α－羥基化反應(yīng)而言，28℃較適宜。

圖5 轉(zhuǎn)化溫度對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of conversion temperature on the conversion rate

3 結(jié) 論

采用微生物轉(zhuǎn)化法，以黑根霉RN－M246為實驗菌種，雄甾－4－烯－3，17－二酮為底物，進行11α－羥基化反應(yīng)合成11α－羥基雄甾－4－烯－3，17－二酮。通過工藝優(yōu)化確定較優(yōu)的工藝為每500mL搖瓶裝入75mL發(fā)酵培養(yǎng)基，同時添加10mmol／L的底物，滅菌后超聲，接入4%的菌懸液，在28℃發(fā)酵72h，轉(zhuǎn)化率比優(yōu)化前提高了約12%，最終轉(zhuǎn)化率可達47.8%。

[1]郭一平，鄭璞.甾體微生物C11α－羥化反應(yīng)的研究進展[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，32(4)：437－441.

[2]郭明，胡昌華.生物轉(zhuǎn)化－從全細胞催化到代謝工程[J].中國生物工程雜質(zhì)，2010，30(4)：110－115.

[3]楊英，姜紹通.微生物降解甾醇側(cè)鏈轉(zhuǎn)化雄甾－4－烯－3，17－二酮的研究進展[J].微生物學(xué)通報，2006，33(6)：142－145.

[4]DAVIS K L，NAPPI J M.The cardiovascular effects of eplerenone，a selective aldosterone－receptor antagonist[J].Clinical Therapeutics，2003，25(11)：2647－2668.

[5]葉麗，史濟平.甾體微生物在制藥工業(yè)中的應(yīng)用[J].工業(yè)微生物，2001，31(4)：40－48.

[6]王普，陳希楊，虞炳鈞，等.新技術(shù)在甾體藥物微生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用[J].化工進展，2002，21(11)：805－813.

[7]PETERSON J A，GRAHAM S E.A close family resemblance：the importance of structure in understanding cytochromes P450[J].Structure，1998，6(9)：1079－1085.