ADAM10在小鼠顱面部膜內(nèi)成骨過程中的表達

譚宇 傅潤卿 房兵 楊秩

顱面部骨骼發(fā)育過程中，大部分骨骼包括額骨、頂骨、枕骨、上頜骨（除顱底軟骨）、下頜骨（除髁突軟骨）都是以膜內(nèi)成骨的方式形成。既往研究表明，膜內(nèi)成骨受多種分子和信號通路調(diào)控[1]，但具體機制仍不清楚。解聚素樣金屬蛋白酶10（A Disintegrin and metalloproteinase，ADAM10）是跨膜蛋白ADAM家族的一員。典型的ADAM10蛋白結(jié)構(gòu)包括N端信號序列、金屬蛋白酶域、整合素域、富半胱氨酸域、跨膜域和胞內(nèi)域。不同功能結(jié)構(gòu)域可能參與不同的生理功能，包括蛋白水解和細胞信號傳導，以及參與細胞黏附和細胞融合[2-4]。腫瘤相關(guān)研究表明，ADAM10在腫瘤發(fā)生與增殖中起調(diào)控作用。ADAM10過表達可促進口腔鱗狀細胞癌的癌細胞生長，而下調(diào)其表達則能降低癌細胞生長[5]。ADAM10基因敲除小鼠可因心血管系統(tǒng)發(fā)育紊亂，在胚胎第9.5天死亡，中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常[6]；繼而在小鼠神經(jīng)干細胞中條件性敲除ADAM10基因，小鼠大腦皮層發(fā)育出現(xiàn)異常，表現(xiàn)為神經(jīng)元的分化和遷移異常[7]。提示ADAM10可能在不同發(fā)育階段和不同生理狀態(tài)下，參與了不同的生理調(diào)控過程。本實驗探討ADAM10在顱面部骨組織發(fā)育過程中的表達變化規(guī)律及亞細胞定位，揭示顱面部膜內(nèi)成骨機制，進一步闡明顱面部骨骼發(fā)育的分子調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料及儀器

C57BL/6小鼠由斯萊克公司提供，飼養(yǎng)于上海交通大學附屬第九人民醫(yī)院SPF級實驗動物房 [實驗動物使用許可，SYXK(滬)2012-0007]。小鼠胚胎發(fā)育時間按檢到陰栓的當日中午定為0.5 d計算。本實驗對動物的處理方法符合中華人民共和國科學技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》。

抗 ADAM10抗體（Abcam公司，英國）；Hoechst（碧云天生物技術(shù)研究所，中國）；抗GM130抗體（Sigma公司，美國）；驢抗小鼠、驢抗兔熒光二抗（Invitrogen，美國）；阿辛藍、茜素紅染劑（Sigma 公司，美國）；HRP 耦聯(lián)二抗（Santa Cruz公司，美國）；組織裂解液（RIPA）（碧云天生物技術(shù)研究所，中國）；胎牛血清（Gibco 公司，美國）；DMEM/F12 培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）。

熒光顯微鏡（Nikon，日本）；PCR 擴增儀（羅氏公司，瑞士）。

1.2 小鼠下頜骨骨組織冰凍切片制備

E17.5胚胎小鼠置于冰上處死，心包灌注沖洗，4%多聚甲醛灌注固定。蔗糖多聚甲醛梯度脫水，4℃保存。待胎鼠完全沉底后，切取頭顱用OCT膠整體包埋，連續(xù)冰凍切片，選取合適位置的切片，60℃烘烤30 min，冷卻至室溫，-20℃保存。

1.3 阿辛藍-茜素紅染色

冰凍切片置于60℃烘箱中烘烤30 min。冷卻至室溫后，阿辛藍染料染色10 min，清水漂洗10 min，茜素紅染色過夜，清水漂洗10 min。乙醇梯度脫水，二甲苯透明后中性樹脂封片。置通風櫥吹干后，光學顯微鏡觀察并攝片。

1.4 組織切片免疫熒光

切片置于60℃烘箱中烘烤10 min，冷卻至室溫，搖床上用PBS清洗3次，每次10 min。將PBS吸干凈，切片水平置于濕盒內(nèi)，加入一抗（1∶100）4℃孵育24 h。PBS清洗3次，每次10 min。將PBS吸干凈，切片水平置于濕盒內(nèi)，加入二抗 （1∶2 000）及Hoechst（1∶2 000），避光 37 ℃孵育 2 h，PBS 避光清洗3次，每次10 min。甘油封片后置于-20℃保存，激光共聚焦顯微鏡觀察并攝片。

1.5 MC3T3細胞系免疫熒光

細胞爬片用鹽酸乙醇處理，烤干后置于24孔板中。MC3T3細胞至對數(shù)生長期時，消化離心重懸并計數(shù)，按每孔1×105個接種于24孔板。隔日用PBS清洗1次（5 min）。4%多聚甲醛-4%蔗糖-PBS固定15 min，PBS清洗 3次，每次 15 min。0.3%Triton-5%BSA-PBS 封閉打孔 1 h。加入一抗（1∶500）4 ℃過夜，PBS 清洗 3 次，每次 15 min。 室溫孵二抗（1∶2 000）及 Hoechst（1∶2 000），2 h，最后用 PBS 清洗 3 次，每次15 min。用Fluorescence-G封片，激光共聚焦顯微鏡觀察并攝片。

1.6 小鼠下頜骨骨組織蛋白樣本制備及蛋白免疫印跡法檢測ADAM10蛋白含量

取 E17.5、P0（出生后 0 天小鼠，Postnatal3）、P3、P7及成年小鼠的下頜骨骨組織，于液氮中研磨，加蛋白裂解液置于冰上30 min，離心后取上清液，測量蛋白濃度后加入蛋白上樣液和DTT制備組織蛋白樣本。用9%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白。5%脫脂奶粉封閉 1 h后，加入一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，GAPDH作內(nèi)參。TBST清洗3次，每次10 min，加標記 HRP的二抗 （CST，1∶2 000） 室溫孵育 2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，顯影。

1.7 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS13.0進行統(tǒng)計學處理，采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠發(fā)育早期顱面部膜內(nèi)成骨區(qū)域

阿辛藍-茜素紅染色顯示P3小鼠鼻中隔、下頜骨梅克爾軟骨和前顱骨等區(qū)域膜內(nèi)成骨明顯?？梢娫诒侵懈糗浌桥杂忻黠@新骨形成；而在下頜梅克爾軟骨外圍，可見茜素紅染色區(qū)域，提示膜內(nèi)成骨活躍區(qū)域緊貼梅克爾軟骨支架。而前顱骨在此時基本已經(jīng)已經(jīng)鈣化成骨（圖1）。

圖1 P3小鼠發(fā)育顱面部骨骼膜內(nèi)成骨區(qū)域Fig.1 Intramembranous ossification regions in P3 mice

2.2 ADAM10在小鼠骨組織中的表達定位

為進一步定位ADAM10在顱面膜內(nèi)成骨過程中的表達，我們選取E17.5小鼠頭顱冠狀切片行免疫熒光組織化學染色，發(fā)現(xiàn)ADAM10在頜面部膜內(nèi)成骨區(qū)域，如鼻中隔、下頜骨梅克爾軟骨和前顱骨均高表達，呈現(xiàn)部位特異性。且可見在梅克爾軟骨外圍膜內(nèi)成骨活躍區(qū)域，ADAM10表達明顯增高，而在梅克爾軟骨區(qū)域表達較低；在鼻中隔旁成骨活躍區(qū)域及鼻黏膜中均高表達；而在鼻中隔軟骨區(qū)域表達相對較低（圖2）。

圖2 ADAM10在小鼠骨組織中的表達定位。Fig.2 Expression of ADAM10 in mice mandibular and nasal septum

2.3 ADAM10在前成骨細胞系MC3T3中的表達

三標免疫熒光技術(shù)提示，ADAM10廣泛分布在胞漿中，在質(zhì)膜和細胞核附近表達高；其胞核附近的高表達信號與高爾基體共標，提示其可能在高爾基體中加工后至細胞膜發(fā)揮功能（圖3）。

圖3 ADAM10在前成骨細胞系MC3T3中的表達Fig.3 Expression of ADAM10 in MC3T3 cell line

2.4 ADAM10在小鼠下頜骨膜內(nèi)成骨過程中的表達變化

為研究ADAM10在顱面膜內(nèi)成骨過程中的表達變化規(guī)律，我們選取小鼠下頜骨區(qū)域行免疫印跡研究，可以見到ADAM10存在兩個條帶，一個是85 KDa的前體形式，一個是剪切后形成的激活形式，分子量約70 KDa?？梢钥吹皆贓17.5、P0、P3和P7，ADAM10非激活形式和激活形式均高表達，但是在成年小鼠中ADAM10表達明顯下降，表明ADAM10主要在顱頜面骨骼發(fā)育早期高表達，提示其可能參與了成骨過程（圖4）。

圖4 ADAM10在小鼠下頜骨膜內(nèi)成骨過程中的表達變化Fig.4 Expression of ADAM10 in mice mandibular during intramembranous ossification

3 討論

本實驗結(jié)果證實，ADAM10在顱面部骨骼發(fā)育過程中呈現(xiàn)時空表達的規(guī)律性變化，在發(fā)育早期高表達，成年后表達明顯減低，并主要定位于膜內(nèi)成骨活躍區(qū)域。提示ADAM10可能參與調(diào)控小鼠顱面部骨骼膜內(nèi)成骨過程，為進一步研究ADAM10在膜內(nèi)成骨中的調(diào)控機制提供了實驗基礎(chǔ)。

顱面部的骨骼系統(tǒng)通過膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨兩種機制成骨。軟骨內(nèi)成骨主要見于髁突軟骨及顱底軟骨黏合。而更主要的形式是膜內(nèi)成骨，其發(fā)生與顱面部絕大部分骨骼的形成有密切關(guān)系，如前顱骨、鼻上頜復合體、下頜骨。因此，本實驗主要關(guān)注顱面膜內(nèi)成骨區(qū)域。通過阿辛藍-茜素紅染色，發(fā)現(xiàn)成骨活躍區(qū)域主要集中在下頜骨梅克爾軟骨外圍，鼻中隔軟骨外側(cè)以及顱頂骨骼，與文獻報道類似[1]。

梅克爾軟骨在下頜骨體部膜內(nèi)成骨中的作用一直存在爭議。一種觀點認為，梅克爾軟骨主要起支持作用，與下頜骨體部膜內(nèi)成骨無直接關(guān)系，隨著胚胎發(fā)育，梅克爾軟骨細胞凋亡、吸收而后消失[8]；另一種觀點認為，梅克爾軟骨參與下頜骨體部的形成。Ishizeki等[9]發(fā)現(xiàn)，梅克爾軟骨的鈣化始于其堿性磷酸酶陽性的軟骨膜，軟骨膜鈣化成骨是下頜骨體部膜內(nèi)成骨的一個標志。本實驗發(fā)現(xiàn)，在梅克爾軟骨四周，即軟骨膜附近ADAM10表達最高，提示ADAM10可能參與了梅克爾軟骨膜區(qū)成骨。在前顱骨，ADAM10主要表達在前顱骨表層骨膜細胞、成骨細胞、骨細胞成骨活躍的區(qū)域，進一步提示ADAM10在膜內(nèi)成骨過程中可能發(fā)揮了極其重要的作用。

MC3T3是小鼠胚胎前顱骨成骨細胞系，常在體外實驗中用來研究膜內(nèi)成骨機制[10]。本實驗發(fā)現(xiàn)，ADAM10在MC3T3細胞中高表達，并廣泛分布在胞膜及胞漿中；在胞核旁的高表達區(qū)域與高爾基體共標，提示其可能在高爾基體中進行修飾，最后轉(zhuǎn)運至細胞膜上，以膜蛋白的形式發(fā)揮作用。這與以往的研究結(jié)果相類似，也提示ADAM10可能以膜蛋白的形式發(fā)揮功能。

作為一種重要的膜蛋白，ADAM10主要通過對其底物的剪切修飾，從而活化相關(guān)信號通路，調(diào)控相應(yīng)的生理功能。比如Notch信號通路，ADAM10通過剪切Notch受體，形成胞內(nèi)段 （Notch intracellular domain，NICD），繼而轉(zhuǎn)運入核，激活其下游基因的表達。在轉(zhuǎn)基因小鼠前成骨細胞高表達Notch1-ICD，可出現(xiàn)骨體積下降的骨質(zhì)缺乏[11]；而轉(zhuǎn)基因小鼠成熟成骨細胞高表達Notch1-ICD，出現(xiàn)生長停滯的骨骼功能紊亂，由于不成熟的成骨細胞增殖旺盛導致骨量增加和骨硬化[12]。以上結(jié)果提示，ADAM10可能通過調(diào)控Notch信號通路調(diào)控骨發(fā)育過程，然而，這一假說需要進一步的實驗論證。

4 結(jié)論

解聚素樣金屬蛋白酶10（ADAM10）廣泛表達在小鼠顱面部膜內(nèi)成骨活躍的區(qū)域。ADAM10在小鼠胚胎期、新生期和成年期的不同表達量，提示ADAM10可能參與調(diào)控膜內(nèi)成骨中成骨細胞分化的過程，為進一步揭示顱面部膜內(nèi)成骨機制提供了有益信息。

[1] Olsen BR,Reginato AM,Wang W.Bone development[J].Annu Rev Cell Dev Biol,2000,16:191-220.

[2] Seals DF,Courtneidge SA.The ADAMs family of metalloproteases:multidomain proteins with multiple functions[J].Genes Dev,2003,17(1):7-30.

[3] Mochizuki S,Okada Y.ADAMs in cancer cell proliferation and progression[J].Cancer Sci,2007,98(5):621-628.

[4] Marcello E,Saraceno C,Musardo S,et al.Endocytosis of synaptic ADAM10 in neuronal plasticity and Alzheimer's disease[J].J Clin Invest,2013,123(6):2523-2538.

[5] Ko SY,Lin SC,Wong YK,et al.Increase of disintergin metalloprotease 10(ADAM10)expression in oral squamous cell carcinoma[J].Cancer Lett,2007,245(1-2):33-43.

[6] Hartmann D,de Strooper B,Serneels L,et al.The disintegrin/metalloprotease ADAM 10 is essential for Notch signalling but not for alpha-secretase activity in fibroblasts[J].Hum Mol Genet,2002,11(21):2615-2624.

[7] Jorissen E,Prox J,Bernreuther C,et al.The disintegrin/metalloproteinase ADAM10 is essential for the establishment of the brain cortex[J].J Neurosci,2010,30(14):4833-4844.

[8] Tomo S,Ogita M,Tomo I.Development of mandibular cartilages in the rat[J].Anat Rec,1997,249(2):233-239.

[9] Ishizeki K,Saito H,Shinagawa T,et al.Histochemical and immunohistochemical analysis of the mechanism of calcification of Meckel's cartilage during mandible development in rodents[J].J Anat,1999,194(Pt 2):265-277.

[10] Tezuka K,Yasuda M,Watanabe N,et al.Stimulation of osteoblastic cell differentiation by Notch[J].J Bone Miner Res,2002,17(2):231-239.

[11] Zanotti S,Smerdel-Ramoya A,Stadmeyer L,et al.Notch inhibits osteoblast differentiation and causes osteopenia[J].Endocrinology,2008,149(8):3890-3899.

[12] Engin F,Yao Z,Yang T,et al.Dimorphic effects of Notch signaling in bone homeostasis[J].Nat Med,2008,14(3):299-305.