馬迪 嚴(yán)佶祺 彭承宏 施敏敏 陳雪華 王維杰 李宏為

研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）已成為組織工程以及細(xì)胞移植治療中的重要種子細(xì)胞，具有廣闊的應(yīng)用前景[1-2]。但是，由于Hayflick界限的存在，BMSCs會(huì)隨著細(xì)胞的分裂出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，嚴(yán)重影響其在組織工程及細(xì)胞移植治療領(lǐng)域的作用。

隨著對(duì)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 （Human telomerase reverse transcriptase，hTERT）的深入研究，導(dǎo)入外源性的hTERT可使細(xì)胞的增殖能力、抗衰老能力得到增強(qiáng)，甚至獲得永生化的能力[3]。將本研究前期已成功構(gòu)建并包裝獲得的含hTERT的重組慢病毒液[4]，感染大鼠BMSCs，觀察細(xì)胞體外增殖分裂情況及其多向分化潛能，為組織工程及細(xì)胞移植治療建立穩(wěn)定的種子細(xì)胞儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

P3大鼠BMSCs（上海消化外科研究所提供）；10%FBS、L-DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基 （美國Gibco公司）；PBS（生工生物工程股份有限公司）；PE標(biāo)記CD29抗大鼠抗體、CD90抗大鼠抗體 （美國BD公司）；PE標(biāo)記CD34抗大鼠抗體 （美國Santa Cruz公司）；PE標(biāo)記CD45抗大鼠抗體（美國Biolegend公司）；成脂誘導(dǎo)分化試劑盒、成骨誘導(dǎo)分化試劑盒（廣州賽業(yè)生物科技有限公司）；Trizol（美國Life Technologies公司）；ReverTra Ace QPCR RT Kit、SYBR Green Realtime PCR Master Mix（日本 TOYOBO公司）；polybrene（美國 Sigma 公司）。

臺(tái)式離心機(jī)5810R （德國Eppendorf公司）；倒置熒光顯微鏡 IX-71（日本 Olympus公司）；BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀 （美國BD公司）；定量PCR儀（瑞士Roche公司）；全光譜微孔板分光光度計(jì)（美國BIOTEK公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組病毒液感染大鼠BMSCs

參照文獻(xiàn)[4]方法，構(gòu)建并獲取含hTERT基因的重組慢病毒液，胰酶消化并調(diào)整大鼠BMSCs密度為2×104個(gè)/孔，加入24孔板，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行病毒感染。一個(gè)24孔板內(nèi)按照每孔10 μL加入重組慢病毒液，另一個(gè)24孔板每孔加入空病毒10 μL，于各孔內(nèi)分別加入polybrene，并調(diào)整終濃度為8 μg/mL，同時(shí)設(shè)置未感染組，分別命名為MSC-hTERT組、MSC-GFP組和MSC組，繼續(xù)培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。感染24 h后更換為含血清完全培養(yǎng)液，待熒光表達(dá)穩(wěn)定后常規(guī)消化收集MSC-hTERT組及MSC-GFP組細(xì)胞，轉(zhuǎn)入6孔板內(nèi)繼續(xù)體外增殖培養(yǎng)；同時(shí)，收集MSC組細(xì)胞，轉(zhuǎn)入6孔板內(nèi)同期體外增殖培養(yǎng)，觀察各組熒光表達(dá)情況、細(xì)胞形態(tài)和傳代情況。

1.2.2 hTERT基因mRNA水平的表達(dá)

收集各組細(xì)胞，分別加入Trizol，抽提總RNA，調(diào)整RNA濃度為0.5 μg/μL，按照 ReverTra Ace qPCR RT Kit說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。根據(jù)hTERT的基因序列 （NM_198253.2），設(shè)計(jì)引物。F：5'GAGAACAAGCTGTTTGCGGG3'；R：5'AAGTTCACCACGCAGCCATA3'。

收集各組細(xì)胞cDNA，按照SYBR Green Realtime PCR Master Mix說明配置反應(yīng)體系，并進(jìn)行Real-Time PCR檢測目的基因的mRNA表達(dá)，以2-△Ct作為基因表達(dá)量，分析各組目的基因的表達(dá)情況。

1.2.3 MSC-hTERT組細(xì)胞周期的檢測

取對(duì)數(shù)生長期的MSC-hTERT及MSC組細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化收集，4℃離心后棄去上清，PBS適度吹打重懸。加入-20℃預(yù)冷的75%乙醇，吹打均勻，制成單細(xì)胞懸液，4℃固定24 h；隔日1 000 r/min離心5 min后棄去上清，PBS漂洗，適度吹打重懸，加入PI和RNA酶，并調(diào)節(jié)PI終濃度為20 μg/mL，RNA 酶終濃度為 50 μg/mL，37 ℃孵育 30 min，流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞周期，并利用自帶軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 MSC-hTERT組細(xì)胞表型的鑒定

取對(duì)數(shù)生長期的MSC-hTERT組細(xì)胞，消化、離心后， 進(jìn)行 CD29、CD34、CD45、CD90 抗體標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型。

1.2.5 MSC-hTERT的成脂誘導(dǎo)及檢測

胰酶消化對(duì)數(shù)生長期的MSC-hTERT組細(xì)胞，設(shè)置誘導(dǎo)組及對(duì)照組，誘導(dǎo)組按照成脂誘導(dǎo)試劑盒說明書添加誘導(dǎo)液進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，對(duì)照組添加含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)液。待細(xì)胞內(nèi)脂滴出現(xiàn)后進(jìn)行油紅O染色，顯微鏡下觀察，鑒定其成脂分化能力。

1.2.6 MSC-hTERT的成骨誘導(dǎo)及檢測

胰酶消化對(duì)數(shù)生長期的MSC-hTERT組細(xì)胞，設(shè)置誘導(dǎo)組及對(duì)照組，誘導(dǎo)組按照成骨誘導(dǎo)試劑盒說明書添加誘導(dǎo)液進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，對(duì)照組添加含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)液，誘導(dǎo)3周后進(jìn)行茜素紅染色，顯微鏡下觀察，鑒定其成骨分化能力。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，兩組以上采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSC-hTERT組細(xì)胞熒光檢測結(jié)果

感染重組慢病毒液后72 h，在熒光顯微鏡下及倒置相差顯微鏡下，觀察細(xì)胞形態(tài)和熒光表達(dá)情況，熒光表達(dá)率約為75%。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞仍保持長梭形外觀和貼壁能力（圖1）。

圖1 重組慢病毒液感染后大鼠BMSCs（左：光學(xué)顯微鏡，40×；右：熒光顯微鏡， 40×）Fig.1 Morphological observation of rat BMSCs infected by recombinant virus supernatant.(Left:Light microscope,40×;Right:Fluorescence microscope,40×)

2.2 Real-Time PCR檢測hTERT基因的表達(dá)

MSC-hTERT組的hTERT基因mRNA表達(dá)明顯高于MSC組和MSC-GFP組，差異顯著（P<0.05）。MSC組與MSC-GFP組hTERT基因表達(dá)量無明顯差異（P>0.05）（圖 2）。

圖2 各組hTERT基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.2 The relative expression of hTERT mRNA in three groups

2.3 MSC-hTERT細(xì)胞周期檢測及體外傳代觀察

采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期的檢測，比較MSC組及MSC-hTERT組細(xì)胞周期檢測結(jié)果，顯示MSC-hTERT組細(xì)胞G2期和S期細(xì)胞，較MSC組明顯增多，增殖指數(shù)明顯上升，分裂增殖潛力提升。體外傳代觀察發(fā)現(xiàn)，MSC-hTERT組細(xì)胞傳代次數(shù)增多，細(xì)胞壽命較MSC組延長，且細(xì)胞形態(tài)得到較好保持（圖 3）。

圖3 MSC組及MSC-hTERT組細(xì)胞周期檢測Fig.3 Cell cycle analysis of MSC group and MSC-hTERT group

2.4 MSC-hTERT組細(xì)胞表型檢測

MSC-hTERT組CD29及CD90的陽性表達(dá)率分別高達(dá)99.83%和99.53%，而CD34及CD45的陽性表達(dá)率僅為0.05%和0.13%（圖4）。

圖4 MSC-hTERT組細(xì)胞表型的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果Fig.4 The expression of surface markers in MSC-hTERT group detected by FCM

2.5 MSC-hTERT組分化潛能檢測

通過成脂、成骨誘導(dǎo)以及特異性染色檢測，MSC-hTERT組細(xì)胞仍然保持了多向分化潛能，在特異性誘導(dǎo)劑的作用下，可向脂肪細(xì)胞以及成骨細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化，而對(duì)照組均未見陽性染色結(jié)果（圖5）。

圖5 MSC-hTERT組細(xì)胞成脂及成骨分化誘導(dǎo)結(jié)果（左：油紅O 染色， 200×；右：茜素紅染色， 200×）Fig.5 Histological observation of cells in MSC-hTERT groups after adipogenic and osteogenic induction(Oil red O staining,200×;Alizarin red staining of group,200×)

3 討論

BMSCs具有很強(qiáng)的自我增殖能力，且能分泌很多細(xì)胞因子，經(jīng)誘導(dǎo)可向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)樣細(xì)胞[5]、血管內(nèi)皮細(xì)胞[6]等分化，并行使相應(yīng)功能，但由于缺乏端粒酶活性，其生存時(shí)間以及分化能力會(huì)隨著細(xì)胞的增殖分裂而受到影響。hTERT決定著人端粒酶的活性。研究表明，轉(zhuǎn)入外源性的hTERT可以提高細(xì)胞端粒酶活性[7]，使細(xì)胞增殖分裂能力增強(qiáng)，甚至可使細(xì)胞永生化。因此，通過外源性轉(zhuǎn)入hTERT基因，恢復(fù)或者增加細(xì)胞的端粒酶活性，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)hTERT的細(xì)胞系，對(duì)于維持BMSCs的分化增殖能力、延長壽命提供了新的方向，有望為組織工程和細(xì)胞移植治療儲(chǔ)備具有旺盛增殖能力的種子細(xì)胞。

本研究運(yùn)用前期實(shí)驗(yàn)獲得的重組慢病毒液和空病毒液，分別感染大鼠BMSCs，發(fā)現(xiàn)MSC-hTERT組能穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光，并且其hTERT基因的mRNA表達(dá)明顯高于MSC組及MSC-GFP組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而在細(xì)胞周期的檢測中，MSC-hTERT組的細(xì)胞增殖指數(shù)相較于MSC組有明顯上升，提示具有復(fù)制潛力和分裂能力的細(xì)胞明顯增多；而體外傳代次數(shù)的增加，以及細(xì)胞形態(tài)能夠在較長時(shí)間內(nèi)保持原有特征等結(jié)果，也提示了異位表達(dá)hTERT能夠上調(diào)細(xì)胞周期，通過DNA修復(fù)基因，使得細(xì)胞具有繞過危機(jī)期、延長壽命的能力[8]。

實(shí)驗(yàn)中所選用的細(xì)胞是否保持其原有生物學(xué)特性對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有重要意義，由于不具備特異性表面標(biāo)記分子，對(duì)MSCs的直接鑒定通常存在一定困難[9]，本實(shí)驗(yàn)對(duì)MSC-hTERT組細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表面標(biāo)記物及定向分化能力的檢測，結(jié)果顯示MSC-hTERT組細(xì)胞仍能保持長梭形外觀，并能夠表現(xiàn)出BMSCs特有的貼壁能力，同時(shí)高表達(dá)CD29及CD90，低表達(dá)CD34及CD45，符合骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。在定向分化研究中，轉(zhuǎn)染hTERT的BMSCs在誘導(dǎo)因子作用下能夠顯示出向骨細(xì)胞以及脂肪細(xì)胞分化的特性，提示MSC-hTERT具有與原代培養(yǎng)BMSCs相同的體外分化潛能。

本研究利用慢病毒載體將hTERT基因成功導(dǎo)入大鼠BMSCs并成功構(gòu)建MSC-hTERT，細(xì)胞的增殖分裂能力得到明顯加強(qiáng)，且仍然保持與BMSCs相同的生物學(xué)特性，可為組織工程研究及細(xì)胞移植治療提供可靠的種子細(xì)胞。

雖然hTERT介導(dǎo)的永生化細(xì)胞系成瘤風(fēng)險(xiǎn)更低，但是基因改造后細(xì)胞可能存在的潛在致瘤性還是不容忽視的。已有研究提示，端粒酶活性已成為腫瘤檢測的一個(gè)新標(biāo)志[10]，同時(shí)異常表達(dá)的hTERT與多項(xiàng)腫瘤成正相關(guān)[11-12]。因此，轉(zhuǎn)染hTERT的大鼠BMSCs的成瘤風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，以及相關(guān)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

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