王彩云，馬云瀚，何大健，楊世華

1. 昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500；

2. 昆明理工大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；

3. 中國科學(xué)院昆明動物研究所，云南 昆明 650223

樹鼩 (tree shrews，Tupaia belangeri)被認(rèn)為是最接近于靈長類的小型哺乳類動物，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)實驗研究中 (Xu et al，2013)。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (induced pluripotent stem cells, iPSc)是指轉(zhuǎn)錄因子Klf4、Sox2和c-Myc等促使體細(xì)胞重編程 (Takahashi & Yamanaka，2006; Takahashi et al，2007)，使其成為具有多潛能性的干細(xì)胞。因為iPS細(xì)胞能形成嵌合體動物而體現(xiàn)其全能性，掀起了人類再生醫(yī)學(xué)研究的熱潮。Sox2基因所編碼的轉(zhuǎn)錄因子對于維持胚胎神經(jīng)嵴干細(xì)胞多能性具有重要作用 (Laga et al，2010)。由Oct4和Sox2基因組成的調(diào)控復(fù)合物控制基因表達(dá)對于維持早期細(xì)胞發(fā)育非常重要 (Okumura-Nakanishi et al，2005)。C-Myc是一種原癌基因，失去該基因后細(xì)胞的重編程進(jìn)度及效率均會顯著降低 (Shi et al，2008)。Klf4能夠連接Nanog的啟動子區(qū)域并直接調(diào)控其表達(dá)，因此，在防止胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）的分化中起重要作用，同時，它也是維護(hù)細(xì)胞自我更新和保持多能性的重要基因 (Zhang et al，2010)。

小鼠及人類等的體細(xì)胞均可通過轉(zhuǎn)錄因子Klf4、Sox2、c-Myc及Oct4等誘導(dǎo)成為多能干細(xì)胞(Takahashi & Yamanaka，2006; Takahashi et al，2007)。但樹鼩多潛能轉(zhuǎn)錄因子的核酸序列至今未見報道，影響了樹鼩iPSc的研究，因此，本研究克隆并解析了樹鼩的多潛能因子Klf4、Sox2和c-Myc等，為研究樹鼩iPSc及基因轉(zhuǎn)錄分析提供了重要數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

選取健康成體樹鼩的骨髓和妊娠期～30 d孕體的不同組織器官 (肝臟、腸及大腦等)。

1.2 簡并引物設(shè)計

通過 GenBank公布的人(NM004235；NM002467；NM003106)、獼猴(NM001142793；NM001142873；NM001142940)、牛(NM001105385；NM001046074；BC133458)及豬等(EU669075；FJ882404；EU503117)的Klf4、Sox2和c-Myc基因序列，用Primier 5.0軟件設(shè)計簡并引物 (Table 1)。

表1 Klf4、Sox2和c-Myc簡并引物Table 1 Klf4,Sox2 and c - Myc degenerate primer

1.3 樹鼩總RNA提取及簡并PCR法擴(kuò)增目的基因

使用RNA prep pure tissue kit (TIANGEN公司)提取樹鼩組織總 RNA，提取方法按試劑盒說明書進(jìn)行。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)實驗按反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara公司)說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)總體系為25 μL： DNA 2 μL，10× 緩沖液 2.5 μL，dNTPs 2 μL，上、下游引物各1 μL，easy TaqDNA聚合酶 (5 U/μL) 0.2 μL，ddH2O 16.3 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃變性 45 s，58～60 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 50 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳分離并純化，再將Klf4、Sox2和c-Myc純化產(chǎn)物與pMD18T載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。37℃轉(zhuǎn)化株在提供X-gal/IPTG的LB培養(yǎng)基中孵育12 h。藍(lán)白斑篩選陽性菌落，且每個基因挑取 5個不同的陽性菌落37 ℃搖床培養(yǎng)12 h，挑取菌斑用于基因測序。測序由上海生工測序公司完成。

1.4 序列分析

所得序列經(jīng)校對后，進(jìn)入GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast分析，同時通過在線軟件 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)對獲得的樹鼩 Klf4、Sox2和c-Myc的部分序列進(jìn)行氨基酸推導(dǎo)。然后從GenBank中下載不同物種的Klf4、Sox2和c-Myc基因，利用 MEGALIGN對序列進(jìn)行排列，并應(yīng)用Mega5.0軟件的鄰接法(NJ)構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹。NJ分析采用Kimura two-parameter距離法，分支樹可信度測試使用自展法 (Bootstrap)檢驗，經(jīng) 1 000次重復(fù)抽樣檢驗得到分支樹節(jié)點的支持率。系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建所用序列見圖4、圖5和圖6。

2 結(jié)果

2.1 樹鼩總RNA的獲取

樹鼩總 RNA采用瓊脂糖凝膠電泳法驗證質(zhì)量(圖 1)，所選取的兩個樣品的 rRNA 三條帶清晰，表明提取的 RNA具有良好的完整性，并適用于后續(xù)實驗。

圖1 樹鼩組織總RNAFigure 1 Total RNA extracted from tissues of tree shrews

2.2 目的片段的檢測

RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳顯示，目標(biāo)條帶與預(yù)期目的基因大小一致(圖2)。

圖2 樹鼩Klf4、Sox2和c-Myc的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 2 Amplification results of Klf4, Sox2, and c-Myc genes by RT-PCR

2.3 樹鼩Klf4、Sox2和c-Myc基因部分片段的序列分析

獲得的 Sox2、c-Myc 和 Klf4部分序列長度[GenBank登錄號分別為Klf4 (K1 KC480548)、Sox2(S1 KC480549) 和 c-Myc (C1 KC480547)]與預(yù)期結(jié)果一致，分別為612、485 和382 bp (測序結(jié)果及推導(dǎo)的氨基酸序列見圖3)。樹鼩Klf4部分序列與人 (Homo sapiens)、獼猴 (Macaca mulatta)、牛 (Bos taurus)、豬 (Sus scrofa)以及鼠 (Mus musculus) 等相應(yīng)序列的相似性分別為 89%、90%、90%、89%和86%，編碼127個氨基酸；Sox2部分序列與人、獼猴、牛、豬及鼠等相應(yīng)序列的相似性分別為98%、97%、96%、97%和95%，編碼204個氨基酸，且該氨基酸序列與獼猴的 Sox2氨基酸序列僅存在 1個氨基酸的差別，相似性高達(dá)99%；c-Myc部分序列與人、獼猴、牛、豬及鼠等相應(yīng)序列的相似性分別為89%、89%、90%、92%和87%，編碼161個氨基酸。

圖3 樹鼩Klf4、Sox2和c-Myc基因部分序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Figure 3 Partial nucleotide and predicted amino acid sequences of Klf4, Sox2, and c-Myc genes in tree shrews

2.4 樹鼩Klf4、Sox2和c-Myc基因部分片段的進(jìn)化分析

在基于 Klf4部分序列以及推導(dǎo)氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹中 (圖4)，各分支具有較高的置信度，說明這些動物之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系具有較高可信度。由系統(tǒng)樹可見，人 (Homo sapiens)、黑猩猩 (Pan troglodytes)和獼猴 (Macaca mulatta)等聚為一類(靈長類)；牛 (Bos taurus)、羊 (Ovis aries)和豬 (Sus scrofa)等聚為一類 (偶蹄類)；小家鼠(Mus_musculus)和褐家鼠 (Rattus norvegicus)等聚為一類(嚙齒類)。其中樹鼩以較高的支持率與靈長類聚為一支。同樣，在基于Sox2部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹中 (圖5)，各類動物聚類情況與Klf4類似，樹鼩同樣與靈長類聚為一支，但支持率有所降低。由于不同類群動物的 Sox2基因推導(dǎo)的氨基酸同源性非常高，系統(tǒng)分析時各分支支持率很低 (結(jié)果未給出)，因而未給出其氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹。在以c-Myc部分序列以及推導(dǎo)氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹中 (圖6)，靈長類、偶蹄類和嚙齒類等雖各聚為一支，但樹鼩以較高的支持率與偶蹄類動物聚為一支。

圖4 基于Klf4基因部分序列以及推導(dǎo)氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 4 Phylogenetic tree of nucleotide sequences (a) and deduced amino acid sequences (b) of the Klf4 gene

圖5 基于Sox2基因部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 5 Phylogenetic tree based on partial nucleotide of the Sox2 gene

圖6 基于c-Myc基因部分序列以及推導(dǎo)氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 6 Phylogenetic tree of nucleotide sequences (a) and deduced amino acid sequences (b) of the c-Myc gene

3 討論

樹鼩的分類學(xué)及生物學(xué)特征研究較為廣泛，已證明其許多生物學(xué)特性可以作為人類疾病模型的重要材料 (Xu et al，2013；Ping et al，2012；Zhang et al，2012)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探索樹鼩的生殖工程和疾病模型提供了重要數(shù)據(jù)。

人(Homo sapiens)的Klf4、Sox2和c-Myc全長分別為2 949、2 520和2 379 bp，本研究獲得的Klf4、Sox2和c-Myc部分序列長度分別為382、612和485 bp，分別對應(yīng)于人相應(yīng)基因的 675～1 060 bp、729～1340 bp 和 1 082～1 566 bp?；?Klf4、Sox2 和c-Myc部分序列的進(jìn)化分析支持偶蹄動物與靈長動物的親緣關(guān)系，較與嚙齒動物的親緣關(guān)系更為接近，與動物種系進(jìn)化關(guān)系相一致。在基于 Klf4和Sox2部分序列構(gòu)建的基因樹中，樹鼩與靈長類動物的親緣關(guān)系更近，而與偶蹄動物和嚙齒動物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。但在c-Myc基因系統(tǒng)進(jìn)化樹中，樹鼩與偶蹄動物的親緣關(guān)系更近。這說明 Klf4、Sox2與c-Myc基因可能在進(jìn)化方式或速度上存在一定的差異。另外，由于本研究中暫未獲得這幾個基因的全長序列而僅克隆了較為保守的部分序列，利用部分序列進(jìn)行進(jìn)化分析，可能不能很準(zhǔn)確反應(yīng)這些類群的真實親緣關(guān)系。

由于目前 GenBank數(shù)據(jù)庫中尚未收錄樹鼩的Klf4和Sox2基因序列，在一定程度上限制了樹鼩的分子生物學(xué)研究。本研究采用簡并 PCR擴(kuò)增，成功克隆了樹鼩Klf4、Sox2和c-Myc基因cDNA的部分序列，為克隆這三種基因的全長提供了良好基礎(chǔ)。

另外，以往的研究認(rèn)為iPS在小鼠疾病模型及胚胎干細(xì)胞研究中具有相似的功能 (Hanna et al，2007)。因此，我們假設(shè)可以通過導(dǎo)入樹鼩的3種基因Sox2、c-Myc和Klf4來誘導(dǎo)樹鼩多潛能干細(xì)胞。推測該模型的評估治療效果較小鼠模型將更加可行。目前關(guān)于樹鼩的這3個基因功能的研究還未見報道，本研究首次對樹鼩Klf4、Sox2和c-Myc三個基因cDNA部分片段進(jìn)行了克隆和序列分析，旨在為進(jìn)一步研究誘導(dǎo)樹鼩多潛能干細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。

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