吳藝飛，丁茁荑，肖 杰，周曉波，彭 淼

（1.湖南省蔬菜研究所，湖南 長沙410125；2.湖南省蔬菜工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙410125；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙410128；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南 長沙410128）

菜薹（Brassica compestris ssp.chinensis var.pupurea Hort.）為十字花科蕓薹屬白菜亞種的變種。通過常規(guī)雜交育種選育一個穩(wěn)定、純合的材料需要3～5 a，是一個耗工耗時的過程。而通過小孢子培養(yǎng)獲得單倍體后進行人工加倍，只需一個世代就可獲得純合的二倍體，作為雜交育種的親本材料，從而大大加速育種進程。因此，小孢子培養(yǎng)在菜薹遺傳和育種中的應(yīng)用越來越受到育種家的重視[1-2]。

試驗采用前期試驗篩選出的較易產(chǎn)生愈傷組織和胚狀體的紅菜薹、白菜薹兩種類型8個不同基因型品種作為材料，對小孢子培養(yǎng)中小孢子密度、激素種類及濃度的配比、材料基因型、對胚狀體誘導(dǎo)頻率的影響，以及瓊脂的濃度對胚狀體再生植株的成苗率的影響進行了系統(tǒng)的研究，以期能進一步優(yōu)化菜薹小孢子培養(yǎng)技術(shù)，提高胚狀體誘導(dǎo)率和再生植株成苗率，為以后培育大量花培植株構(gòu)建DH群體，進行遺傳性狀篩選、分子標記、遺傳圖譜和基因定位研究等奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料紅菜薹，分別為H09-1、H09-2、H09-3、H09-4，白菜薹，分別為B09-1、B09-2、B09-3、B09-4，總共8份材料，由湖南省蔬菜研究所菜薹課題組提供。所有材料均于2011年12月播于大棚苗床中，2012年2月移栽至溫室中，人工調(diào)控最適溫度和濕度，加強肥水管理，促進植株壯苗。2012年3月中下旬進入花期后開始進行試驗，注意及時打頂，以促進側(cè)枝的萌發(fā)和新花芽的形成，延長供體植株的花期和取樣時間。

1.2 試驗方法

1.2.1 小孢子培養(yǎng)方法（1）花蕾的采集、處理和滅菌。從菜薹現(xiàn)蕾開始，于上午9:00以前用鑷子采摘各不同品種的花蕾放入自封塑料袋中（為減少試驗誤差，每一品種花蕾摘自4個不同株系的花蕾混合），裝入冰盒帶回實驗室。摘去已經(jīng)開放或花萼開裂的花蕾，其余裝入玻璃瓶中置于4°C冰箱中低溫預(yù)處理24 h。將經(jīng)過低溫預(yù)處理的花蕾去除過大和過小的以及表面有損傷開裂的花蕾，只留2.5～3.5mm左右的花蕾，其花瓣為花藥的1/2～4/5（經(jīng)鏡檢此時小孢子大都處于單核早期或單核靠邊期）。花蕾先用70%酒精消毒15 s，再用0.1%升汞滅菌15 min后，用無菌水漂洗5次，洗凈升汞殘液，備用。

（2）花蕾的研磨、小孢子的收集與分裝。將滅菌后的花蕾放入研缽中，加入5 mL B5-13（1968年B5培養(yǎng)基，蔗糖濃度為13%，pH值5.8，121°C下滅菌25 min）洗滌溶液，用玻璃棒輕輕擠壓花蕾，使小孢子游離到洗滌液中，用200目尼龍網(wǎng)篩過濾去花蕾組織碎片，再加5 mL新鮮洗滌液沖洗研缽和濾網(wǎng)，收集小孢子懸浮液，將其移入10 mL離心管中，經(jīng)800 r/min離心4 min，倒去懸浮液留小孢子，再加5 mL B5-13洗滌液后離心留小孢子，最后將收集的小孢子加入適量的NLN-13（1987年NLN培養(yǎng)基，蔗糖濃度為13%，pH值5.8，0.45μm濾膜過濾滅菌）培養(yǎng)液，用血球計數(shù)板調(diào)整至需要的小孢子濃度，最后分裝至無菌培養(yǎng)皿（Φ60 mm）中，每皿裝小孢子懸浮液4 mL，用Parafilm封口。

（3）胚狀體誘導(dǎo)。將裝有小孢子的培養(yǎng)皿置于33°C高溫下熱激處理24 h，而后轉(zhuǎn)至25°C室溫黑暗條件繼續(xù)靜置培養(yǎng)，直至出現(xiàn)肉眼可見的胚狀體。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計胚狀體數(shù)目。

（4）植株再生。產(chǎn)生的胚狀體依次經(jīng)過球形、心形、魚雷形、子葉形。胚狀體的出現(xiàn)具有不同步性，同一培養(yǎng)皿中可觀察到各個不同形態(tài)的胚狀體。當胚齡為20～30 d時，將培養(yǎng)皿從黑暗環(huán)境中拿出，放在弱光下培養(yǎng)1～2 d，待胚狀體轉(zhuǎn)綠后再將子葉形胚狀體轉(zhuǎn)入無激素的MS培養(yǎng)基中，置于1 500 lx光強下，每天光照12 h，25°C培養(yǎng)。培養(yǎng)7～10 d后，大部分子葉形胚可分化成綠芽，25～30 d待綠芽長出3～4片真葉后，將小植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基MS+NAA 0.1 mg/L中誘導(dǎo)生根，長成完整的植株。

1.2.2 試驗設(shè)計 （1）不同基因型對小孢子出胚的影響。以8種基因型菜薹為試材，將小孢子濃度調(diào)整到2×105個/mL，接種在添加1.0 mg/L 6-BA和0.4 mg/LNAA的NLN-13液體培養(yǎng)基中，每處理接種5皿，3次重復(fù)。30 d后統(tǒng)計不同基因型菜薹小孢子的出胚率。

（2）不同小孢子濃度對胚狀體誘導(dǎo)的影響。設(shè)置4個小孢子濃度梯度：1×105、2×105、3×105、4×105個/mL。接種在不添加激素的NLN-13的液體培養(yǎng)基中，每處理接種5皿，設(shè)3次重復(fù)。30 d后統(tǒng)計出胚情況。

（3）激素種類和濃度的配比對胚狀體誘導(dǎo)的影響。以NLN-13為基本培養(yǎng)基，以H09-1和B09-1為試材，采用兩因素多水平試驗，考察兩種激素6-BA（0、0.5、1.0、1.5 mg/L）和NAA（0、0.2、0.4 mg/L）的濃度配比對胚狀體誘導(dǎo)的影響。每處理接種30個花蕾，3次重復(fù)，30 d后統(tǒng)計出胚情況。

（4）瓊脂濃度對胚狀體再生成苗的影響。設(shè)置4個瓊脂濃度梯度：6、8、10、12g/L，以MS為基本培養(yǎng)基，不添加激素，添加0.5 g/L活性炭，蔗糖30 g/L，考察瓊脂濃度對胚狀體再生成苗的影響。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)采用SAS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型菜薹對小孢子出胚率的影響

表1可知，不同基因型對小孢子出胚的影響非常大，各基因型出胚率差異顯著或極顯著。供試的4個紅菜薹品種有2個誘導(dǎo)出胚，誘導(dǎo)率為50%，出胚率最高的是H09-1，平均產(chǎn)胚為1.11個/蕾，單皿最高產(chǎn)胚為21個；品種H09-2次之，小孢子胚誘導(dǎo)率為0.75個/蕾；而供試的4個白菜薹品種中也有2個誘導(dǎo)出胚，誘導(dǎo)率為50%，出胚率最高的是B09-1，為0.51個/蕾。B09-4為B09-1和B09-3的雜交F1代，出胚率為0.15個/蕾。H09-3、H09-4、B09-2、B09-3均未誘導(dǎo)出胚。

表1 不同基因型菜薹對小孢子出胚率的影響

2.2 不同小孢子濃度對出胚率的影響

由圖1可知，小孢子濃度與胚狀體出胚率關(guān)系密切，濃度過高或過低均不利于胚狀體的發(fā)生。從供試的4個品種來看，在一定的范圍內(nèi)，隨著小孢子濃度的升高，胚狀體的發(fā)生也呈現(xiàn)上升趨勢，當小孢子濃度為2×105個/mL時，產(chǎn)生的胚狀體數(shù)均達到最高值；之后即使再增加小孢子濃度（3×105、4×105個/mL），小孢子胚狀體誘導(dǎo)率反而有下降的趨勢。因此，菜薹小孢子培養(yǎng)最適宜的小孢子濃度為2×105個/mL。

圖1 小孢子濃度對小孢子出胚率的影響

2.3 激素種類和濃度配比對胚狀體誘導(dǎo)的影響

由表2可知，激素種類和濃度配比與胚狀體誘導(dǎo)率密切相關(guān)。6-BA和NAA的濃度和配比對菜薹小孢子培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)影響很大，各處理差異顯著。所有組合均可以誘導(dǎo)出胚狀體，6-BA對胚狀體誘導(dǎo)率、子葉形胚產(chǎn)率以及畸形胚比例的影響比NAA大，在一定范圍內(nèi)隨著6-BA濃度升高，胚狀體的數(shù)目也隨之增長，但畸形胚的比率也出現(xiàn)上升的趨勢；NAA在一定范圍內(nèi)隨著濃度的升高，胚產(chǎn)量有小幅的增長，但增幅沒有6-BA大，隨著NAA濃度的升高，子葉形胚占的比重有所增長，畸型胚比例下降，但濃度過高會抑制胚狀體的發(fā)生?？偟膩碚f，1.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA是菜薹小孢子培養(yǎng)最適的胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素組合。

2.4 瓊脂濃度對胚狀體再生成苗的影響

表3看出，瓊脂濃度與胚狀體再生成苗率關(guān)系密切，各處理差異均達顯著和極顯著水平。當瓊脂含量為6 g/L時，胚狀體的再生成苗率非常低，兩個品種都在10%左右。瓊脂的含量在10 g/L時胚狀體的成苗率最高，品種H09-1和B09-1的成苗率分別為66.7%和65%，是瓊脂含量為12 g/L的處理的1.5倍，是瓊脂含量為8 g/L的2倍。因此，最適的培養(yǎng)基瓊脂含量在8～10 g/L為宜，胚狀體成苗率最高。

表2 激素種類和濃度的配比對小孢子出胚率的影響

表3 瓊脂濃度對胚狀體成苗的影響

3 小結(jié)與討論

3.1 基因型與胚狀體的誘導(dǎo)

材料的基因型的差異是影響菜薹小孢子培養(yǎng)出胚率的主要因素，這一現(xiàn)象在其他蔬菜小孢子培養(yǎng)中普遍存在[3-4]。在供試的8份不同基因型材料中，只有4份材料誘導(dǎo)出了胚狀體，其他4份材料即便采取了很多措施仍然無法誘導(dǎo)出胚，這說明是基因型的差異導(dǎo)致的結(jié)果。試驗發(fā)現(xiàn)，通過將出胚率低的品種與出胚率高的品種雜交之后，取其F1代的花蕾再進行小孢子培養(yǎng)，其出胚率會得到提高。筆者認為這可能是由于出胚率高的品種及其后代的基因中攜帶有這種控制出胚的基因，且這種基因是呈顯性遺傳的。

3.2 小孢子濃度與胚狀體的誘導(dǎo)

小孢子培養(yǎng)時小孢子濃度的高低對胚狀體的誘導(dǎo)有一定的影響。濃度過高或過低均不利于小孢子胚的發(fā)生。試驗中4個基因型的研究結(jié)果均表明，菜薹小孢子培養(yǎng)最適宜的小孢子濃度為2×105個/mL，低于這一濃度胚狀體產(chǎn)生大大降低，筆者認為這可能是由于小孢子胚發(fā)育過程中，小孢子之間會產(chǎn)生一種相互促進的物質(zhì)，這種物質(zhì)也需要小孢子達到一定濃度才會產(chǎn)生的密集效應(yīng)；而當小孢子濃度過高時，小孢子間相互爭奪生存空間和營養(yǎng)物質(zhì)，胚狀體產(chǎn)率反而下降，也可能是由于小孢子發(fā)育過程中會分泌一些有害物質(zhì)，這些有害物質(zhì)積累到一定程度反而造成胚產(chǎn)率的下降，這有待進一步研究。

3.3 激素種類和濃度配比與胚狀體的誘導(dǎo)

小孢子培養(yǎng)時，通過向培養(yǎng)基中添加適當?shù)募に貙ε郀铙w的誘導(dǎo)有一定的增效，這一措施在很多作物小孢子培養(yǎng)中都有運用。國內(nèi)外的學(xué)者添加的激素多為2,4-D、KT、6-BA、NAA，因材料的基因型不同，添加的激素種類和濃度不盡相同，需通過多次試驗來確定最佳的激素種類和濃度的配比[5-6]。

試驗結(jié)果表明在一定范圍內(nèi)添加不同的激素種類和濃度，其胚狀體誘導(dǎo)率均不同。6-BA對胚狀體誘導(dǎo)率的影響比NAA大，6-BA的作用主要表現(xiàn)在提高了胚狀體或愈傷組織的誘導(dǎo)率，但隨著濃度的升高，子葉型胚的比例呈下降趨勢，畸形胚的比例呈上升趨勢。NAA的作用主要表現(xiàn)為在一定范圍內(nèi)可以提高子葉型胚的比例，降低畸形胚的比例，但濃度過高會對胚狀體的發(fā)生起抑制作用。在菜薹的小孢子培養(yǎng)中最佳的胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為NLN-13+1.0mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA。

3.4 胚狀體植株再生

小孢子培養(yǎng)產(chǎn)生的胚狀體誘導(dǎo)再生植株的成苗率很低，這一現(xiàn)象在很多其他植株小孢子培養(yǎng)中普遍存在[7]。試驗將瓊脂的濃度由6～7 g/L提高到10～12 g/L，大大提高了胚狀體再生成苗率。這可能是小孢子胚成熟后需要一個相對干燥的生長環(huán)境造成的，也可能同合子胚成熟后逐漸干燥進入休眠狀態(tài)的機理有些相似[8]。所以改變水勢對胚產(chǎn)生一定的水分脅迫作用，可提高成苗率和再生植株的質(zhì)量。

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