白金燕 馬福祥 賀蘭 金燕

(陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 陜西西安 710062)

為了培養(yǎng)本科生的實(shí)踐能力與探索新知的精神，在基礎(chǔ)分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)中增設(shè)了研究型實(shí)驗(yàn)，讓學(xué)生根據(jù)自己的興趣選擇指導(dǎo)教師，開(kāi)展研究工作。目前環(huán)境污染和食品安全方面的問(wèn)題引起大家的廣泛關(guān)注，學(xué)生對(duì)于利用所學(xué)知識(shí)進(jìn)行環(huán)境污染監(jiān)測(cè)也非常感興趣。鉛在工業(yè)中的用途很廣，同時(shí)鉛在自然界中普遍存在，又因?yàn)槠渚哂胁豢山到庑院蜕锔患?yīng)，故易導(dǎo)致鉛污染。鉛能作用于人的全身系統(tǒng)和器官，危及神經(jīng)、消化器官、心血管、腎臟等[1-4]。因此，建立簡(jiǎn)單、靈敏、快速檢測(cè)鉛離子的方法，對(duì)食品安全和環(huán)境監(jiān)測(cè)有重要意義。在查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，我們?cè)O(shè)計(jì)了利用熒光探針與DNA作用導(dǎo)致熒光信號(hào)改變檢測(cè)水樣中鉛離子的實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)有助于學(xué)生了解科學(xué)研究工作的基本過(guò)程，培養(yǎng)學(xué)生查閱、歸納總結(jié)文獻(xiàn)的能力，分析與解決問(wèn)題的能力，數(shù)據(jù)分析能力及科技論文寫作能力。

1 實(shí)驗(yàn)原理

結(jié)晶紫屬于三苯甲烷類染料，分子內(nèi)容易發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致平面結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲，光活性降低。結(jié)晶紫本身熒光信號(hào)很弱，而當(dāng)結(jié)晶紫與單鏈凝血酶DNA適體混合后，其熒光信號(hào)將有所增強(qiáng)。在鉛離子存在條件下，單鏈凝血酶DNA適體發(fā)生構(gòu)型改變，形成四鏈體DNA，可導(dǎo)致體系的熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)。利用這種基于結(jié)晶紫與不同結(jié)構(gòu)的凝血酶適體作用方式的差異而引起的熒光信號(hào)的改變，可實(shí)現(xiàn)對(duì)鉛離子含量的檢測(cè)。

2 試劑與儀器

2.1 儀器

PB-10pH計(jì)，電子分析天平，Hitachi F-7000熒光分光光度計(jì)。

2.2 試劑

凝血酶適體(5′-GGT TGG TGT GGT TGG-3′，簡(jiǎn)稱TBA)由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。三羥甲基氨基甲烷、醋酸、結(jié)晶紫(crystal violet，簡(jiǎn)稱CV)、Pb(NO3)2、KNO3、AgNO3、Cd(NO3)2、Ca(NO3)2、Mg(NO3)2、Zn(NO3)2、Al(NO3)3、Fe(NO3)3、NaF、乙腈(CH3CN)、抗壞血酸(Vc)、三乙醇胺(TEA)、乙二胺(EDA)都為分析純。配制濃度為1mmol/L的結(jié)晶紫溶液，10mmol/L Tris-acetate緩沖溶液(pH分別為6.0,6.5,7.0,7.5,8.0)，溶劑均為超純水。用10mmol/L Tris-acetate(pH 7.0)緩沖溶液配制凝血酶適體的儲(chǔ)備液，濃度為25μmol/L。

3 實(shí)驗(yàn)方法

將一定量10μmol/L的結(jié)晶紫溶液加入微量熒光比色皿中，檢測(cè)其熒光信號(hào)。將10μmol/L結(jié)晶紫與5μmol/L凝血酶適體混合，作用半小時(shí)，取一定量加入到微量熒光比色皿中，檢測(cè)熒光信號(hào)。然后加入不同濃度的Pb2+，每次加量為1μL，使其最終濃度分別為50nmol/L、100nmol/L、500nmol/L、1μmol/L、5μmol/L，混合均勻，進(jìn)行光譜掃描，觀察熒光光譜的變化。激發(fā)波長(zhǎng)Ex=590nm，掃描范圍610～750nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為10nm，光電倍增管電壓為950V。

4 結(jié)果與討論

4.1 凝血酶適體與結(jié)晶紫濃度比的選擇

4.2 作用時(shí)間的考察

將10μmol/L結(jié)晶紫與5μmol/L凝血酶適體混合，每隔5分鐘檢測(cè)一次熒光強(qiáng)度。作用半小時(shí)后,加入5μmol/L Pb2+并混合均勻，再每隔5分鐘檢測(cè)一次熒光強(qiáng)度，以考察凝血酶適體與結(jié)晶紫作用時(shí)間及Pb2+的響應(yīng)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在反應(yīng)初期，隨著時(shí)間的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增大，說(shuō)明與結(jié)晶紫結(jié)合的凝血酶適體的量逐漸增加。反應(yīng)30分鐘后，體系的熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，所以在檢測(cè)前需先將凝血酶適體與結(jié)晶紫培育30min，然后再加入Pb2+。結(jié)果表明，加入Pb2+后，體系的熒光強(qiáng)度將發(fā)生變化；至加入Pb2+10 分鐘后，體系的熒光強(qiáng)度基本不再改變。故確定鉛的作用時(shí)間為10分鐘。

4.3 pH的選擇

在10mmol/L Tris-acetate，pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0緩沖溶液中檢測(cè)5μmol/L Pb2+和5μmol/L凝血酶適體、10μmol/L結(jié)晶紫的熒光強(qiáng)度，選出凝血酶適體與結(jié)晶紫作用的最佳pH。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)pH為7.0時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度的變化最明顯，因此，我們選擇pH為7.0的10mmol/L Tris-acetate緩沖溶液為反應(yīng)介質(zhì)。

4.4 工作曲線及線性范圍

在Pb2+濃度為1nmol/L～10μmol/L范圍內(nèi)，lg[Pb2+]與熒光強(qiáng)度的變化(F0-F)/F0呈線性關(guān)系，線性方程為y=0.99+0.11x，線性相關(guān)系數(shù)R=0.992；信噪比為3時(shí)，檢測(cè)限為5×10-10mol/L。此方法的線性范圍較寬，檢測(cè)限低，基本上能夠滿足對(duì)于食品或環(huán)境中鉛和汞污染的監(jiān)測(cè)。

4.5 干擾離子的考察

由于多種離子都會(huì)誘導(dǎo)凝血酶適體與結(jié)晶紫發(fā)生構(gòu)型改變，為了準(zhǔn)確檢驗(yàn)鉛離子，希望該方法只對(duì)Pb2+響應(yīng)，這就需要使用掩蔽劑來(lái)掩蔽其他離子對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中使用了4種掩蔽劑(38μmol/L乙腈，1.72mmol/L抗壞血酸，20μmol/L三乙醇胺，1.72mmol/L氟化鈉)，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，進(jìn)行了選擇性實(shí)驗(yàn)，取Na+和K+濃度為20μmol/L，其他金屬離子濃度均為5μmol/L。結(jié)果表明，這4種掩蔽劑基本上不影響Pb2+反應(yīng)。當(dāng)選擇20μmol/L三乙醇胺和1.72mmol/L抗壞血酸作掩蔽劑時(shí)，可以將其他金屬離子的干擾降到最小。即在合適掩蔽劑存在的條件下，該方法對(duì)Pb2+具有較好的選擇性。

4.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用我們?cè)O(shè)計(jì)的方法測(cè)定了自來(lái)水和湖水樣品中的Pb2+。對(duì)于自來(lái)水，要打開(kāi)水管放水20min后收集，煮沸5min以去除氯。湖水用0.2μm過(guò)濾膜過(guò)濾掉雜質(zhì)，再煮沸5min以去除氯。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)該方法與標(biāo)準(zhǔn)方法無(wú)顯著性差異，結(jié)果令人比較滿意(表1)。

表1 兩種測(cè)Pb2+方法比較

表中數(shù)據(jù)為5次測(cè)定結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

以上結(jié)果表明，我們建立的方法簡(jiǎn)單易行，在適當(dāng)?shù)难诒蝿┫逻x擇性好、靈敏度高、檢測(cè)限低、成本低廉、操作簡(jiǎn)便。傳統(tǒng)的鉛離子檢測(cè)方法有原子吸收分光光度法、原子熒光光譜法、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法、示波極譜法等，這些方法具有設(shè)備昂貴、耗時(shí)、方法繁瑣等缺點(diǎn)，有的甚至使用了劇毒試劑，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員危害比較大。因此，發(fā)展測(cè)試方法簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、現(xiàn)象直觀、成本低廉、試劑無(wú)毒或低毒的測(cè)定方法很有意義。

5 教學(xué)效果討論

本文介紹了一個(gè)能體現(xiàn)學(xué)科交叉研究特點(diǎn)的研究型實(shí)驗(yàn)。學(xué)生在完成實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，不僅要應(yīng)用化學(xué)分析和儀器分析的理論知識(shí)，而且還能學(xué)習(xí)到核酸的基本性質(zhì)及樣品處理技術(shù)。學(xué)生在大量查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，在教師的指導(dǎo)下，運(yùn)用自己所學(xué)的理論知識(shí)，完成了實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)。在實(shí)驗(yàn)完成過(guò)程中，對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)的把握、異常問(wèn)題的解決、數(shù)據(jù)的分析整理，都有助于鍛煉學(xué)生的實(shí)踐能力，經(jīng)歷理論付諸實(shí)踐的過(guò)程；同時(shí)，學(xué)生也能從中體會(huì)到主動(dòng)獲得新知的樂(lè)趣，激發(fā)進(jìn)行科學(xué)研究的興趣和信心。此實(shí)驗(yàn)在陜西師范大學(xué)已開(kāi)設(shè)兩年，教學(xué)效果良好。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Foster W G,McMahon A,Rice D C.ToxicolIndHealth,1996,12:723

[2] Loghman-Adman M.HealthPerspect,1997,105:928

[3] Ronis M J,Badger T M,Shema S T,etal.ToxicolEnvironHealth,1998,53:327

[4] He L,Poblenz A T.JBiolChem,2000,275:12175