當(dāng)歸多糖對(duì)衰老模型小鼠抗氧化作用及p16蛋白表達(dá)水平的影響

安方玉，劉雪松，李雪燕，關(guān)德鳳，梁健慶，張艷霞

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730000;2.甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，甘肅蘭州730000)

衰老又叫老化，是隨著年齡增加自身機(jī)能減退，結(jié)構(gòu)及組分進(jìn)行性退變的一種病理現(xiàn)象［1］。機(jī)體衰老時(shí)，常常會(huì)引起細(xì)胞增殖功能低下、蛋白酶活性下降等，最終導(dǎo)致臟器萎縮、功能低下［2］。已有研究證實(shí):當(dāng)歸多糖作為當(dāng)歸的有效成分之一，具有抗腫瘤、抗炎、增強(qiáng)免疫力、延緩衰老、治療老年癡呆等廣泛藥理作用［3－4］。本研究聯(lián)合D－半乳糖和亞硝酸鈉制備小鼠衰老模型，觀察小鼠腦組織中p16蛋白的表達(dá)、單胺氧化酶(MAO)的活性變化，肝組織及腎組織中MAO和過氧化氫酶(CAT)的活性變化，以期為當(dāng)歸延緩衰老提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為中藥治療老年病的研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

清潔級(jí)昆明種小鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):SCXK(甘)2011－0001－0001126。

1.2 藥品、試劑與儀器

當(dāng)歸多糖，陜西慈緣生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)CY110320，用生理鹽水配制成10 g/L的儲(chǔ)備液，備用。D－半乳糖，北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品，批號(hào)020123，臨用前用生理鹽水配制成12 g/L備用;亞硝酸鈉，西安化學(xué)試劑廠產(chǎn)品，批號(hào)860723，臨用前用生理鹽水配制成9 g/L備用;MAO測(cè)定試劑盒(批號(hào)20120715)、CAT試劑盒(批號(hào)20120725)、考馬斯亮藍(lán)測(cè)定試劑盒(批號(hào)20120816)，均由南京建成生物工程研究所提供;p16 ELISA檢測(cè)試劑盒，上海江萊生物科技有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20120825。SK3300H型數(shù)控超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司產(chǎn)品;VIS－723N型紫外可見分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器有限公司產(chǎn)品;BS224S型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;HH－4數(shù)顯恒溫水浴鍋，鄭州杜甫儀器廠產(chǎn)品;XYJ80－20型離心機(jī)，金壇市恒豐儀器廠產(chǎn)品;XW－80A型旋渦混勻器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品;ZY12306型微量加樣器，德國(guó)BRAND公司產(chǎn)品;DG3022型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，華東電子管廠產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組、給藥與模型的建立

將60只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，當(dāng)歸多糖低、中、高劑量組，腦復(fù)康組6組，每組10只。采用灌胃給藥法，當(dāng)歸多糖高、中、低劑量組分別按照 400，200，100 μg/g 劑量給藥［4］，腦復(fù)康組按照 200 μg/g劑量給藥，模型對(duì)照組及空白對(duì)照組灌服等體積的生理鹽水。給藥同時(shí)，模型對(duì)照組，當(dāng)歸多糖高、中、低劑量組，腦復(fù)康組每日腹腔注射D－半乳糖120 μg/g和亞硝酸鈉 90 μg/g 各 0.2 mL［4－5］，空白對(duì)照組腹腔注射等體積的生理鹽水，治療8周。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

8周后，眼球采血處死小鼠，取其大腦、肝、腎組織用冷生理鹽水沖洗后備用。

1.4.1 腦組織生化指標(biāo)

用電子天平稱量腦組織，用生理鹽水按1∶9的比例稀釋成100 g/L腦勻漿，采用普通離心法，3 000 r/min離心10 min，以微量加樣槍吸取上清液待用。利用芐胺作為底物，在MAO作用下，生成產(chǎn)物芐醛，用環(huán)己烷提取，測(cè)定242 nm處的吸光度值，計(jì)算MAO的活力。酶蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。p16蛋白含量的測(cè)定采用ELISA檢測(cè)法。操作步驟按照試劑盒的操作說明執(zhí)行。

1.4.2 肝組織生化指標(biāo)

用電子天平稱量肝組織，用生理鹽水按照1∶9的比例稀釋成100 g/L肝勻漿，采用普通離心法，3 000 r/min離心10 min，以微量加樣器吸取上清液待用。MAO活力的測(cè)定方法同1.4.1。利用 CAT在一定條件下可以分解底物過氧化氫(H2O2)，使H2O2在反應(yīng)體系中的濃度逐漸降低，吸光度也逐漸降低，利用紫外分光光度法在240 nm處測(cè)定OD1和OD2值，計(jì)算出CAT的活力。酶蛋白含量的測(cè)定方法同1.4.1。操作步驟按照試劑盒的操作說明執(zhí)行。

1.4.3 腎組織生化指標(biāo)

用電子天平稱量腎組織，用生理鹽水按照1∶9的比例稀釋成100 g/L腎勻漿，采用普通離心法，3 000 r/min離心10 min，以微量加樣器吸取上清液待用。MAO活力的測(cè)定方法、酶蛋白含量的測(cè)定方法同1.4.1。CAT 活力的測(cè)定方法同 1.4.2。操作步驟按照試劑盒的操作說明執(zhí)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腦組織p16蛋白表達(dá)對(duì)比

與空白對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組小鼠腦組織p16蛋白表達(dá)增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。當(dāng)歸多糖各劑量組腦組織p16蛋白的表達(dá)較模型對(duì)照組降低，以中、高劑量組明顯，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05或 P＜0.01);但與腦復(fù)康組對(duì)比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組小鼠腦組織p16蛋白表達(dá)對(duì)比 ±s

表1 各組小鼠腦組織p16蛋白表達(dá)對(duì)比 ±s

注:與空白對(duì)照組對(duì)比，＊＊P＜0.01;與模型對(duì)照組對(duì)比，#P＜0.05，##P ＜0.01。

組 別 動(dòng)物數(shù) 劑量/(μg·g－1) p16/(μg·L－1)10 4.12 ±0.56模型對(duì)照組 10 7.91 ±0.60＊＊腦復(fù)康組 10 200 5.12 ±0.53##當(dāng)歸多糖低劑量組 10 100 7.09 ±0.31#當(dāng)歸多糖中劑量組 10 200 5.82 ±0.59##當(dāng)歸多糖高劑量組 10 400 4.71 ±0.62空白對(duì)照組##

2.2 各組小鼠腦組織MAO活性對(duì)比

與空白對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組小鼠腦組織MAO的活性升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。當(dāng)歸多糖各劑量組腦組織MAO活性較模型對(duì)照組下降，以中、高劑量組明顯，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01);但與腦復(fù)康組對(duì)比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表2。

表2 各組小鼠腦組織MAO活性對(duì)比 ±s

表2 各組小鼠腦組織MAO活性對(duì)比 ±s

注:與空白對(duì)照組對(duì)比，＊＊P ＜0.01;與模型對(duì)照組對(duì)比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

組 別 動(dòng)物數(shù) 劑量/(μg·g－1) MAO/(U·mgprot－1)10 6.34 ±1.10模型對(duì)照組 10 8.32 ±2.45＊＊腦復(fù)康組 10 200 3.34 ±0.34##當(dāng)歸多糖低劑量組 10 100 6.70 ±0.71#當(dāng)歸多糖中劑量組 10 200 3.61±0.86＊＊##當(dāng)歸多糖高劑量組 10 400 2.19 ±2.01＊＊##空白對(duì)照組

2.3 各組小鼠肝組織MAO活性和CAT活性對(duì)比

與空白對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組小鼠肝組織MAO活性升高、CAT活性下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。當(dāng)歸多糖各劑量組與模型對(duì)照組對(duì)比，肝組織MAO的活性雖降低但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)、CAT活性升高且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05或 P＜0.01);但與腦復(fù)康組對(duì)比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表3 各組小鼠肝組織MAO活性和CAT活性對(duì)比 ±s

表3 各組小鼠肝組織MAO活性和CAT活性對(duì)比 ±s

注:與空白對(duì)照組對(duì)比，＊＊ P ＜0.01;與模型對(duì)照組對(duì)比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

組 別 動(dòng)物數(shù) 劑量/(μg·g－1) MAO/(U·mgprot－1) CAT/(U·gprot－1)6.17 ±1.01 363.54.74 ±89.30模型對(duì)照組 10 10.26±2.04＊＊ 175.02±55.94＊＊腦復(fù)康組 10 200 8.34 ±1.31 309.74 ±25.93##當(dāng)歸多糖低劑量組 10 100 9.92 ±2.53 234.35 ±25.89＊＊#當(dāng)歸多糖中劑量組 10 200 8.78 ±1.37 278.75 ±47.73＊＊##當(dāng)歸多糖高劑量組 10 400 7.19 ±2.21 347.94 ±41.21空白對(duì)照組10##

2.4 各組小鼠腎組織MAO活性及CAT活性對(duì)比

與空白對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組小鼠腎組織MAO活性升高、CAT活性下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型對(duì)照組對(duì)比，當(dāng)歸多糖各劑量組使腎組織MAO活性明顯降低、CAT活性明顯升高，以中、高劑量組最為明顯，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或 P＜0.01);與腦復(fù)康組對(duì)比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表4。

表4 各組小鼠腎組織MAO活性和CAT活性對(duì)比 ±s

表4 各組小鼠腎組織MAO活性和CAT活性對(duì)比 ±s

注:與空白對(duì)照組對(duì)比，＊＊P ＜0.01;與模型對(duì)照組對(duì)比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

組 別 動(dòng)物數(shù) 劑量/(μg·g－1) MAO/(U·mgprot－1) CAT/(U·gprot－1)10 10.93 ±1.49 340.99 ±70.73模型對(duì)照組 10 15.54±1.98＊＊ 163.49±52.01＊＊腦復(fù)康組 10 200 10.07 ±1.45## 284.25 ±30.19##當(dāng)歸多糖低劑量組 10 100 12.13 ±2.18# 240.30 ±46.44＊＊#當(dāng)歸多糖中劑量組 10 200 10.41 ±1.54## 278.23 ±42.49＊＊##當(dāng)歸多糖高劑量組 10 400 9.68 ±2.62## 297.94 ±29.10*##空白對(duì)照組

3 討論

細(xì)胞衰老是生物體衰老的基本單元，也是各種老年病的發(fā)病基礎(chǔ)。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，衰老機(jī)制的研究日趨深入，特別是衰老過程中p16基因的表達(dá)受到廣泛關(guān)注。p16基因是一種細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子，在人類細(xì)胞衰老過程中持續(xù)高表達(dá)［6］。金建生等［7］報(bào)道:將 WI-38 細(xì)胞從第24代開始與不同濃度的人參皂苷Rg1共同培養(yǎng)后，p16、CyclinD1表達(dá)水平降低，CDK4表達(dá)水平增加，說明Rg1延緩衰老的機(jī)制可能是改變細(xì)胞周期調(diào)控因子的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。Duan等［8］以p16基因正反義載體分別轉(zhuǎn)染年輕的人成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)p16基因mRNA高表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞早衰，而其反義載體轉(zhuǎn)染通過抑制p16基因mRNA表達(dá)可以延緩細(xì)胞衰老。韓旭等［9］研究也證實(shí):參黃沖劑可有效改善衰老患者的臨床癥狀，提高日常生活能力，提高血清NO含量和SOD活性，減少p16基因mRNA的表達(dá)，提示參黃沖劑抗衰老的機(jī)制是通過抑制衰老細(xì)胞增殖而實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果也顯示:模型對(duì)照組小鼠腦組織p16蛋白的表達(dá)量增加(P＜0.01);給予當(dāng)歸多糖干預(yù)后，小鼠腦p16蛋白的表達(dá)降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。提示當(dāng)歸多糖具有抑制衰老細(xì)胞增殖的作用。

有研究證實(shí):體內(nèi)代謝或外源性因素產(chǎn)生的自由基可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［10］。自由基是指在最外層軌道中含有未配對(duì)電子的原子、原子團(tuán)或特殊狀態(tài)的分子。機(jī)體在正常情況下通過酶類和非酶類防御系統(tǒng)清除自身產(chǎn)生的自由基。但是，隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體抗氧化酶的活性逐漸下降，清除自由基的能力不斷下降，導(dǎo)致機(jī)體氧自由基發(fā)生蓄積中毒;同時(shí)，這些氧自由基與核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂質(zhì)等反應(yīng)，促進(jìn)了機(jī)體的衰老［11］。其中MAO和CAT是研究衰老的重要指標(biāo)之一。許多研究證明，MAO活性隨年齡增加［12］，CAT 活性隨年齡降低［13］。本研究結(jié)果也證實(shí):模型對(duì)照組小鼠MAO活性升高，CAT活性降低(P＜0.01);給予當(dāng)歸多糖干預(yù)后，小鼠腦組織和腎組織MAO活性明顯降低、肝組織和腎組織CAT活性明顯增強(qiáng)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。提示當(dāng)歸多糖具有抗氧化作用。

綜上所述:當(dāng)歸多糖具有延緩衰老的作用，其機(jī)制可能與提高機(jī)體抗氧化能力和下調(diào)衰老相關(guān)基因p16的過度表達(dá)有關(guān)。

［1］鄒承魯.當(dāng)代生物學(xué)［M］.北京:中國(guó)致公出版社，2000:394－396.

［2］童坦君，張宗玉.衰老機(jī)制及其學(xué)說［J］.生理科學(xué)進(jìn)展，2007，38(1):14 －18.

［3］胡小平，李玉云，李先何，等.當(dāng)歸多糖的成分及藥理學(xué)研究新進(jìn)展［J］.中藥材，2004，27(1):70 －72.

［4］徐露，董志.當(dāng)歸多糖抗衰老的實(shí)驗(yàn)研究［J］.激光雜志，2008，29(4):89 －90.

［5］張妍.復(fù)方丹參對(duì)早老性癡呆動(dòng)物的作用及機(jī)制研究［D］.北京:北京中醫(yī)藥大學(xué)，2008.

［6］李堅(jiān)，王艾琳，孟繁軍.細(xì)胞衰老與凋亡關(guān)系的研究［J］.北京大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2005，6(1):43－46.

［7］金建生，趙朝暉，陳曉春，等.人參皂苷Rg1延緩衰老作用可能與改變p16、cyclinD、CDK4的表達(dá)有關(guān)［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2004，9(1):29－34.

［8］Duan J，Zhang Z，Tong T.Senescence delay of human diploid fibroblast induced by anti－ sense p16INK4α expression［J］.J Biol Chem，2001，276:48325.

［9］韓旭，李七一，郭宏敏，等.參黃沖劑對(duì)衰老患者抗氧化作用及p16基因mRNA表達(dá)的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2011，18(11):11 －14.

［10］Buttke TM ，Sandstrom PA Oxidative Stress as a mediator of apoptosis［J］.Immunol Today，1994，15(1):7 －10.

［11］張萌，廉潔.復(fù)方地黃對(duì)老年性癡呆大鼠的行為學(xué)及腦內(nèi)SOD、MAO的活性影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，8(7):50 －52.

［12］張大偉，李楠，庾英蘭，等.丹參注射液對(duì)老齡小鼠心、腦、肝臟MAO活性的影響［J］.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2011，34(4):56－57.

［13］王嵐，梁日新，楊濱，等.黃芩及紅花水提物對(duì)快速老化模型小鼠的抗衰老作用研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(13):159 －162.