李雪燕，陳開兵，張麗云

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730000;2.甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，甘肅蘭州730000)

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸的干燥根，味甘、辛，性溫，歸肝、心、脾經(jīng)，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止帶、潤腸通便等功效，在臨床中被廣泛應(yīng)用［1］。當(dāng)歸多糖為當(dāng)歸的有效成分之一，有研究［2］報(bào)道其具有延緩衰老的作用，但機(jī)制尚不十分清楚。本研究通過觀察當(dāng)歸加多糖對D－半乳糖和亞硝酸鈉聯(lián)合腹腔給藥所致亞急性衰老擬癡呆模型小鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，從細(xì)胞凋亡角度進(jìn)一步探討其延緩衰老的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

清潔級昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號:SCXK(甘)2011－0001－0001126。

1.2 藥品、試劑與儀器

當(dāng)歸多糖，陜西慈緣生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號CY110320，用生理鹽水配制成10 g/L的儲(chǔ)備液，備用;腦復(fù)康，湖南迪諾制藥有限公司生產(chǎn)，批號101110。D－半乳糖，北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品，批號020123，臨用前用生理鹽水配制成12 g/L備用;亞硝酸鈉，西安化學(xué)試劑廠產(chǎn)品，批號860723，臨用前用生理鹽水配制成9 g/L備用;Bcl-2蛋白ELISA試劑盒(批號20120703)和Bax蛋白ELISA試劑盒(批號20120715)，上海江萊生物科技有限公司產(chǎn)品。SK3300H型數(shù)控超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司產(chǎn)品;BS224S型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;HH－4數(shù)顯恒溫水浴鍋，鄭州杜甫儀器廠產(chǎn)品;XYJ80－20型離心機(jī)，金壇市恒豐儀器廠產(chǎn)品;XW－80A型旋渦混勻器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品;ZY12306型微量加樣器，ScienTiFic公司產(chǎn)品;WGC小鼠水迷宮，安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品;RT－6100型酶標(biāo)儀，美國Rayto公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組、給藥與模型的建立

將72只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組，模型對照組，腦復(fù)康組，當(dāng)歸多糖低、中、高劑量組6組，每組12只。除空白對照組外，其余各組每日腹腔注射 D－半乳糖 120 μg/g和亞硝酸鈉90 μg/g［2－3］聯(lián)合給藥建立衰老小鼠模型;空白對照組腹腔注射等體積的生理鹽水，連續(xù)30 d。30 d后，在腹腔注射的同時(shí)，腦復(fù)康組給予腦復(fù)康200 μg/g，當(dāng)歸多糖高、中、低劑量組分別按照 400，200，100 μg/g灌胃給藥;模型對照組及空白對照組灌服等體積的生理鹽水，連續(xù)6周。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 學(xué)習(xí)成績和記憶成績

末次給藥后，進(jìn)行Y型迷宮試驗(yàn)［4］。迷宮共分為3個(gè)互通的臂，實(shí)驗(yàn)測試時(shí)，加入溫水(維持25±2℃)，使水面高于平臺約1 cm，再加入原味奶粉，使水成不透明乳白色。工作電壓50～70 V。以A為起步區(qū)，B為安全區(qū)，C為危險(xiǎn)區(qū)。小鼠在起步區(qū)受到電擊后，1次性跑入安全區(qū)為正確，否則為錯(cuò)誤，此即為1次訓(xùn)練。下1次訓(xùn)練以B為起步區(qū)，C為安全區(qū)，A為危險(xiǎn)區(qū)，依次往復(fù)。共訓(xùn)練33次，其中前3次作為小鼠適應(yīng)環(huán)境不進(jìn)入統(tǒng)計(jì)，記錄后30次中的錯(cuò)誤次數(shù)，為學(xué)習(xí)成績。24 h后，用同樣的方法測試，為記憶成績。

1.4.2 腦組織生化指標(biāo)

Y型迷宮測試后，將小鼠快速斷頭處死，取其腦組織用生理鹽水制成10 g/L腦勻漿，3 000 r/min低溫離心10 min，取上清液備用。ELISA法測定Bcl-2蛋白和Bax蛋白含量。具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠學(xué)習(xí)和記憶成績對比

與空白對照組對比，模型對照組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)成績和記憶成績測試中的錯(cuò)誤次數(shù)增多，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說明造模成功。與模型對照組對比，腦復(fù)康組和當(dāng)歸多糖3個(gè)劑量組小鼠學(xué)習(xí)和記憶中的錯(cuò)誤次數(shù)均減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或 P＜0.05)，尤以當(dāng)歸多糖中、高劑量組明顯(P＜0.01)，且此兩組與腦復(fù)康組對比，差別亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或 P＜0.05)。見表 1。

表1 各組小鼠學(xué)習(xí)和記憶成績對比 ±s

表1 各組小鼠學(xué)習(xí)和記憶成績對比 ±s

注:與空白對照組對比，＊＊P ＜0.01;與模型對照組對比，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與腦復(fù)康組對比，△ P ＜0.05，△△ P ＜0.01。

組 別 動(dòng)物數(shù) 劑量/(μg·g－1) 每30次中錯(cuò)誤次數(shù)學(xué)習(xí)成績/次 記憶成績/次12 － 17.07 ±1.39 14.40 ±1.50模型對照組 12 － 19.07±1.83＊＊ 17.01±1.36＊＊腦復(fù)康組 12 200 16.27 ±1.49## 14.93 ±1.03##當(dāng)歸多糖低劑量組 12 100 17.07 ±1.39# 15.60 ±1.24#當(dāng)歸多糖中劑量組 12 200 14.53±1.46##△ 13.40±2.59##△當(dāng)歸多糖高劑量組 12 400 14.07±1.28##△△ 12.80±2.18##△△空白對照組

2.2 各組小鼠腦組織Bcl-2和Bax蛋白含量對比

與空白對照組對比，模型對照組小鼠腦組織Bcl-2和Bax蛋白的含量均升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型對照組對比，腦復(fù)康組和當(dāng)歸多糖3個(gè)劑量組Bcl-2蛋白含量增高、Bax蛋白含量降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或 P＜0.05)。與腦復(fù)康組對比，當(dāng)歸多糖高劑量組Bcl-2蛋白含量增高、Bax蛋白含量降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表 2。

表2 各組小鼠腦組織Bcl-2和Bax蛋白含量對比 ±s

表2 各組小鼠腦組織Bcl-2和Bax蛋白含量對比 ±s

注:與空白對照組對比，＊＊P ＜0.01;與模型對照組對比，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與腦復(fù)康組對比，△△ P ＜0.01。

組 別 動(dòng)物數(shù) 劑量/(μg·g－1) Bcl-2蛋白/(μg·L－1) Bax蛋白/(μg·L－1)12 － 2.60 ±0.46 4.66 ±0.42模型對照組 12 － 3.33±0.43＊＊ 6.11±1.20＊＊腦復(fù)康組 12 200 4.14 ±0.56## 5.35 ±0.41##當(dāng)歸多糖低劑量組 12 100 3.87 ±0.45# 5.54 ±0.48#當(dāng)歸多糖中劑量組 12 200 4.36 ±0.37## 4.99 ±0.52##當(dāng)歸多糖高劑量組 12 400 5.03±0.25##△△ 4.62±0.33##△△空白對照組

3 討論

細(xì)胞凋亡是一個(gè)主動(dòng)的、有序的、受控的過程，參與調(diào)控的基因目前已發(fā)現(xiàn)幾十個(gè)，按其功能可分為促凋亡基因(如Bax，p53，Caspase等)和抗凋亡基因(如 Bcl-2，Bcl-x，Hsp等)兩大類，由這些基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物參與決定了細(xì)胞的存活或死亡［5－6］。促凋亡基因和抗凋亡基因組成一個(gè)平衡體系，任何因素破壞這一平衡體系就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞對外界的敏感性增加，從而破壞其結(jié)構(gòu)和功能。多種因素導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和多種因素的抗凋亡作用都會(huì)通過調(diào)控 Bcl-2 家族的表達(dá)而完成［7－8］。因此，Bcl-2和Bax在腦衰老的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用，Bcl-2和Bax的表達(dá)強(qiáng)度決定細(xì)胞命運(yùn)，Bcl-2占優(yōu)勢時(shí)細(xì)胞生存，Bax占優(yōu)勢時(shí)細(xì)胞死亡［9］。

已有研究［1－2］證實(shí)，當(dāng)歸及當(dāng)歸多糖確有延緩衰老的作用，但對其機(jī)制的研究主要集中于自由基學(xué)說。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測了當(dāng)歸多糖對亞急性衰老擬癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)、記憶能力及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)的影響。結(jié)果表明:造模后，在機(jī)體的自我保護(hù)機(jī)制下，Bcl-2蛋白表達(dá)反應(yīng)性增強(qiáng)，且啟動(dòng)了凋亡程序，Bax表達(dá)增強(qiáng)，破壞了Bcl-2/Bax基因平衡，導(dǎo)致Bcl-2/Bax的比值下降，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。藥物干預(yù)后，當(dāng)歸多糖低、中、高劑量組均能使小鼠腦組織中Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)，Bax表達(dá)減弱，Bcl-2/Bax的比值增高，抑制細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到延緩衰老，改善衰老模型小鼠學(xué)習(xí)、記憶能力的目的，尤以高劑量組最為明顯，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。說明當(dāng)歸多糖低劑量已表現(xiàn)出不同程度的延緩衰老作用，高劑量作用更為理想。然而，細(xì)胞凋亡是通過一系列連鎖反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的，涉及不同基因及其產(chǎn)物的調(diào)控和信號傳遞系統(tǒng)的正負(fù)調(diào)節(jié)，故當(dāng)歸多糖抑制腦細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

［1］李麗麗，劉向前，張曉丹.當(dāng)歸屬植物研究進(jìn)展［J］.中成藥，2009，31(4):601 －607.

［2］徐露，董志.當(dāng)歸多糖抗衰老的實(shí)驗(yàn)研究［J］.激光雜志，2008，29(4):89 －90.

［3］張妍.復(fù)方丹參對早老性癡呆動(dòng)物的作用及機(jī)制研究［D］.北京:北京中醫(yī)藥大學(xué)，2008.

［4］王躍春，王子棟，孫黎明，等.動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的Y－型迷宮測試法［J］.暨南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2001，22(5):137.

［5］Kerr JF，Wyllie AH，Currie AR.Apoptosis:a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics［J］.Br J Cancer，1972，26(4):239.

［6］Williams GT，Smith CA.Molecular regulation of apoptosis:genetic controls on cell death［J］.Cell，1993，74(5):777.

［7］Desagher S，Martinou JC.Mitochondria as the central control point of apoptosis［J］.Trends Cell Biol，2000，10(9):369.

［8］Parone P，Priault M，James D，et al.Apoptosis:bombarding the mitochondria［J］.Essays Biochem，2003，39:41 －51.

［9］Su JH，Anderson AJ，Cummings BJ，et al.Immunohistochemical evidence for apoptosis in Alzheimer＇s disease［J］.Neuroreport，1994，5(18):25 －33.