李 虹，葉 云，王國(guó)俊△

（1.四川省樂(lè)山市人民醫(yī)院藥劑科 614000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，四川瀘州 646000）

近年來(lái)，細(xì)菌耐藥相關(guān)研究備受關(guān)注，1999年有研究小組提出防突變濃度（mutant prevention concentration，MPC）和突變選擇窗（mutant selection window，MSW）理論［1］，MPC是指防止第一步耐藥突變株被選擇性富集擴(kuò)增所需的最低抗菌藥物濃度。最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）與 MPC之間的濃度范圍定義為MSW。MSW相關(guān)理論認(rèn)為：只有藥物濃度在野生型藥物敏感菌的 MIC和 MPC之間即在 MSW內(nèi)時(shí)，耐藥突變菌株才被選擇性擴(kuò)增。當(dāng)藥物濃度低于MIC時(shí)，由于它可使整個(gè)病原菌群增強(qiáng)，沒(méi)有選擇壓力而不會(huì)導(dǎo)致耐藥突變菌株被選擇。當(dāng)藥物濃度高于 MPC時(shí)，由于細(xì)菌必須同時(shí)產(chǎn)生兩種或兩種以上耐藥突變才能生長(zhǎng)，因此也不會(huì)有耐藥突變菌株被選擇出來(lái)。這一理論為解決抗菌藥物的耐藥問(wèn)題提供了新思路。關(guān)于 MPC和 MSW的研究，目前主要集中在氟諾酮（fluoorquinolone，F(xiàn)Q）類等西藥抗菌藥物對(duì)肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌、結(jié)核分支桿菌、非結(jié)核分支桿菌等的體外實(shí)驗(yàn)研究［2-4］。雖然大量文獻(xiàn)報(bào)道中藥具有抑菌作用［5-7］，但相關(guān)研究主要集中在對(duì)中藥及其制劑的 MIC的測(cè)定［8］，對(duì)其 MPC、MSW的研究目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本文擬體外測(cè)定3種中藥注射液的MIC、MPC、MSW，探討中藥注射液抑制金黃色葡萄球菌耐藥突變菌株選擇能力，為中藥在抗感染性疾病方面的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌ATCC29213，中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.1.2 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（杭州天和微生物試劑有限公司，批號(hào)：100804）；MH瓊脂（杭州天和微生物試劑有限公司，批號(hào)：100804）。

1.1.3 藥物 大蒜素注射液 （徐州萊恩藥業(yè)有限公司，2mL：30mg，批號(hào)：1008261）；雙黃連粉針（哈藥集團(tuán)中藥二廠，600 mg／支，批號(hào)：1003015）；喜炎平（江西青峰藥業(yè)有限公司，2 mL：50mg，批號(hào)：20101115）。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 CO2培養(yǎng)箱（HH.CP-01，上海一恒科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備 從新鮮過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌平板上挑取多個(gè)菌落接種于含10mL營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中，并標(biāo)記為管A，置于孵育箱中24h。24h后，拿出管A并采用活菌計(jì)數(shù)法對(duì)管A中金黃色葡萄球菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。將管A搖勻后，取20μL，經(jīng)5次10倍稀釋后，取最后一個(gè)稀釋度的菌液20μL均勻的涂布在血平皿上，同法做4個(gè)平行對(duì)照。并標(biāo)記為1、2、3、4。將4個(gè)血平皿放入37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，長(zhǎng)出菌落后，計(jì)數(shù)，并根據(jù)最后的平均結(jié)果推算出原菌液的含菌數(shù)。此時(shí)管A中金黃色葡萄球菌的數(shù)目約為2×1012CFU／mL。將已知菌落數(shù)的管A經(jīng)一系列稀釋后，將菌液稀釋于試管中調(diào)整為6×105CFU／mL，并標(biāo)記為管B，將管A、B置于4℃中冷藏保存。

1.2.2 MIC的測(cè)定 采用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂2倍稀釋法，分別測(cè)定雙黃連粉針、喜炎平注射劑、大蒜素注射劑3種中藥注射液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC，每一濃度設(shè)6個(gè)平行對(duì)照。陰性對(duì)照組為未加藥物的培養(yǎng)基。陽(yáng)性對(duì)照組按參考文獻(xiàn)進(jìn)行配制（測(cè)定MIC的陽(yáng)性對(duì)照組的藥物濃度為0.13μg／mL的左氧氟沙星）［9］。倍比遞增藥物濃度，配制含雙黃連粉針、喜炎平注射液、大蒜素注射液的幾個(gè)濃度梯度的MH瓊脂平板。取20μL管B中細(xì)菌均勻涂抹在各含藥平皿上，使MH瓊脂上接種菌量為1.2×104CFU，用L形棒均勻涂布，并繞壁2圈。每個(gè)濃度6個(gè)平皿，根據(jù)CLSI 2005年標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀結(jié)果。37℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果，以平板上無(wú)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度定為MIC。

1.2.3 MPC的測(cè)定 采用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂2倍稀釋法分別測(cè)定雙黃連粉針、喜炎平注射劑、大蒜素注射劑3種中藥注射液對(duì)金黃色葡萄球菌的MPC，每一濃度設(shè)6個(gè)平行對(duì)照。陰性對(duì)照組為未加藥物的培養(yǎng)基。陽(yáng)性對(duì)照組按參考文獻(xiàn)進(jìn)行配制（測(cè)定MPC的陽(yáng)性對(duì)照組的藥物濃度為1.3μg／mL左氧氟沙星）［9］。以MIC為基準(zhǔn)，倍比遞增藥物濃度，制備幾個(gè)濃度梯度的含不同藥物濃度的MH瓊脂平皿。取20μL管A菌液均勻涂抹在各含藥平皿上，并繞壁2圈，每個(gè)藥物濃度用6個(gè)平皿，使每個(gè)藥物濃度平皿的細(xì)菌總接種量為1.2×1010CFU。并置于培養(yǎng)箱中37℃孵育，24、48、72h后觀察各平皿中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)情況，孵育72h后仍無(wú)細(xì)菌菌落生長(zhǎng)的最低藥物濃度為暫定MPC（MPCpr），再以 MPC（MPCpr）為基準(zhǔn)線性增減20%，重復(fù)MPCpr的測(cè)定步驟，每濃度作6個(gè)平皿，以平皿中不出現(xiàn)菌落生長(zhǎng)的最低藥物濃度即為MPC。對(duì)接近MPC藥物濃度篩選出來(lái)菌株接種無(wú)藥物的瓊脂平板上，傳代2次后再接種于原篩選藥物濃度的平板上，以確保其是耐藥突變株。

1.2.3 MSW和SI的計(jì)算 藥物MIC和MPC之間的范圍即為MSW。藥物的MPC與MIC的比值（MPC／MIC）即為藥物選擇指數(shù)SI。

2 結(jié) 果

2.1 MIC的測(cè)定 結(jié)果表明：雙黃連粉針的MIC為1.905 mg／mL，喜炎平注射劑的 MIC＞1.000mg／mL，大蒜素注射劑的MIC為5.960×10-3mg／mL。見(jiàn)表1。

表1 3種中藥注射液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC（n=6）

2.2 MPC的測(cè)定 結(jié)果表明：雙黃連粉針MPC為14.737 mg／mL；喜炎平注射劑的 MPC＞15.385mg／mL；大蒜素注射劑MPC為3.850×10-2mg／mL。見(jiàn)表2。

表2 3種中藥注射液對(duì)金黃色葡萄球菌的MPC（n=6）

續(xù)表2 3種中藥注射液對(duì)金黃色葡萄球菌的MPC（n=6）

2.3 3種中藥注射液的MSW及SI 結(jié)果表明：雙黃連粉針和大蒜素注射劑的SI值相差不是特別大，并且兩種中藥制劑的SI都小于左氧氟沙星，從小到大依次為：大蒜素注射液小于雙黃連粉針小于左氧氟沙星。見(jiàn)表3。

表3 3種中藥注射液的MSW及SI

3 討 論

隨著加入的喜炎平注射液越多，瓊脂板變得越來(lái)越柔軟，在接種細(xì)菌時(shí)很容易使其破裂，所以未制作含更大濃度的喜炎平注射液的瓊脂平板進(jìn)行MIC和MPC值的測(cè)定。本研究表明，大蒜素注射液、喜炎平注射液、雙黃連粉針對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC29213均有不同作用的抑制作用，其抑菌能力為大蒜素注射液大于雙黃連粉針大于喜炎平注射液。李朝霞等［10］測(cè)定了6種不同抗菌藥物左氧氟沙星、阿奇霉素、利福平、萬(wàn)古霉素、妥布霉素、氯霉素對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC29213的MIC、MPC和 MSW。它們的 MIC分別為0.125、1.0、0.002、0.5、3.0、0.5μg／mL；MPC分別為1.4、51.2、＞1 024、4.8、16、16 μg／mL。這6種抗菌藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的MSW差異很大，以利福平的MSW最寬（SI＞512 000），氯霉素的 MSW最窄（SI=5.3）。比較而言，以上3種中藥制劑對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC29213的MIC值均明顯高于西藥抗菌藥物，表明其抗菌作用弱于西藥抗菌藥物，但雙黃連粉針及大蒜素注射液對(duì)金黃色葡萄球菌的選擇指數(shù)均較低，且明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組的左氧氟沙星，說(shuō)明上述中藥制劑限制耐藥突變菌株選擇的能力較強(qiáng)，提示某些中藥在對(duì)抗細(xì)菌耐藥方面可能發(fā)揮其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。而大蒜素注射液的MIC及MPC值遠(yuǎn)小于雙黃連的MIC及MPC值，提示大蒜素注射液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌能力比較強(qiáng)。大蒜素較強(qiáng)的抑菌作用可能是因?yàn)槠渚哂歇?dú)特的藥理活性——容易透過(guò)磷脂膜和紅細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而與一些截留化合物相互作用，實(shí)現(xiàn)其藥理價(jià)值［11］。

［1］Dong Y，Zhao X，Domagala J，et al.Effect of fluoroquilonone con-centration on selection of resistant mutants of Mycobacterium bovis BCG and staphylococcus aureus［J］.Antimicro Agents Chemother，1999，43（7）：1756-1760.

［2］Blondeau JM，Zhao X，Hnasen J，et al.Mutnat Prevention concentrat-ion of fluoorquinolones or clinical isolates of strptococcus pneumo-niae［J］.Antimierob Agents Chemother，2001，45（2）：433-438.

［3］Zhao X，Eisner W，Perl-Rosenthal N，et al.Mutnat Prevention conce-ntration of garenoxacin（BMS-284756）for ciPorfloxacin-susepetible and ciprofloxacin resistnat staphylococcus aureus［J］.Antimierob Agents Chemother，2003，47（3）：1023-1027.

［4］Li X，Marinao N，Rhaal JJ，et al.Quinolone-resistnat haemophilus influenzae：detemrination of mutant seleetion window for ciprofloxacin，garenoxacin，levofloxacin，andmoxifloxacin［J］.Antimieorb Agents Chemother，2004，48（11）：4460-4462.

［5］李建志，劉繼紅，楊麗珍，等.11種中草藥抗菌作用實(shí)驗(yàn)研究［J］.中醫(yī)藥信息，2009，3（26）：82-83.

［6］王靜，張淑文.中藥逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥的研究進(jìn)展［J］.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，1（6）：153-155.

［7］蔡啟娟，汪輝，陳向東.中藥對(duì)臨床耐藥株體外抗菌活性的研究［J］.藥物生物技術(shù)，2009，16（8）：568-572.

［8］王育紅，李風(fēng)學(xué)，張志清，等.24種中藥水煎劑與免煎顆粒劑對(duì)臨床菌株的體外抑菌作用［J］.江蘇中醫(yī)藥，2006，4（27）：52-54.

［9］庚俐莉，江玲，王承敏，等.單藥及聯(lián)合用藥對(duì)金黃色葡萄球菌突變選擇窗的影響［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2007，11（30）：864-865.

［10］李朝霞，劉又寧，王睿，等.幾種抗菌藥物在不同濃度時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌耐藥突變株的影響［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2007，12（2）：163-167.

［11］Miron T，Rabinkov A，Mirelman D，et al.The mode of action of a-llicin：its ready permeability through phospholip ids membranes may contribute toits biological activityl［J］.Biochi Biophys Acta，2000，1463（1）：20-30.