HPLC－ESI－MS／MS鑒定夏枯草的主要化學(xué)成分

梁杰康 張 琳 嚴(yán)曉明

（1 廣東省食品藥品監(jiān)督管理局審評(píng)認(rèn)證中心，廣東510080；2 廣東省婦幼保健院，廣州511400；3 韶關(guān)市食品藥品檢驗(yàn)所，韶關(guān)512026）

夏枯草是唇形科夏枯草屬植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥果穗，有時(shí)也以全草入藥，因 “此草夏至后即枯”故名，始載于 《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為下品，其味 “苦辛寒，治寒熱瘰疬，鼠瘺頭痛，破癥，散癭結(jié)氣，腳腫濕痹，輕身，一名乃東，生川谷”，為中醫(yī)臨床常用的一味中藥［1－2］。夏枯草具有清肝、明目、散結(jié)、消腫、止痛之功效，可用于目赤腫痛、目珠夜痛、羞明流淚、頭痛眩暈、瘰疬、癭瘤、乳癰腫痛［3］，臨床多用于治療甲狀腺腫大、淋巴結(jié)核、乳腺增生、高血壓、肺結(jié)核、急性黃疸型傳染性肝炎等疾?。?］。研究表明、咖啡酸、迷迭香酸、蘆丁、槲皮素等為夏枯草藥材中的重要活性成分［5－7］，具有多種藥理活性［8］。夏枯草是廣東涼茶常用藥材，主要以水煎煮或浸泡的方式服用，研究其水提液的活性成分具有重要的意義，然而，相關(guān)研究尚無報(bào)道。本文通過高效液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法 （HPLC－EIS－MS／MS）分析鑒定夏枯草水提液的主要化學(xué)成分，HPLC－EIS－MS／MS為近年來快速發(fā)展的現(xiàn)代分析技術(shù)，具有靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠提供豐富的化合物結(jié)構(gòu)信息，在中藥活性成分鑒定方面具有很大的優(yōu)勢(shì)。

1 儀器與試劑

Agilent 1200－6410B高效液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀；Agilent Zorbax SB－C18高效液相色譜柱 （150×2.1mm，3.5μm）；乙腈為色譜純，水為去離子水，其它試劑為分析純；對(duì)照品葡糖糖酸和檸檬酸購自美國Sigma公司，原兒茶酸、咖啡酸和迷迭香酸購自中國藥品生物制品檢定所；夏枯草藥材購自廣州大參林連鎖藥店，經(jīng)鑒定為夏枯草 （Prunella vulgaris L.）。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 樣品提取 稱取夏枯草5g，置圓底燒瓶中，加入100mL蒸餾水，加熱煮沸后提取1h，提取液冷卻后轉(zhuǎn)移至100mL的容量瓶中，蒸餾水定容，過0.45μm濾膜，待分析。

2.2 色譜及質(zhì)譜條件 色譜條件：Zorbax SB－C18高效液相色譜柱 （150mm×2.1mm，3.5μm）；流動(dòng)相A為0.5%的甲酸溶液，B為乙腈；梯度洗脫：0～1min，99%A 1%B；1～10min，1%～12%B；10～35min，12%～55%B；后運(yùn)行5min，99%A 1%B。流速0.3mL／min；進(jìn)樣量5μL。

質(zhì)譜條件：ESI離子源，負(fù)離子檢測(cè)模式；霧化氣和干燥氣為N2氣，碰撞氣為氬氣；干燥氣溫度：350℃，干燥氣流速：8L／min；霧化氣壓力：40psi；裂解電壓：175V，毛細(xì)管電壓：4000V，碰撞能量：0～25V；質(zhì)譜掃描范圍為m／z 50～1000。

3 結(jié)果

圖1為夏枯草水提液的HPLC－ESI－MS／MS色譜圖，譜圖中有10個(gè)主要的色譜峰，其保留時(shí)間、相對(duì)峰面積、一級(jí)質(zhì)譜、二級(jí)質(zhì)譜、分子式和推測(cè)鑒定的化合物詳細(xì)信息見表1。

化合物1的 ［M－H］－＝195，對(duì)該離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生m／z＝177、159、129和99的碎片離子，其中m／z＝177和159為失去1個(gè)和2個(gè)分子H2O所致，該化合物在反相C18柱的保留非常弱，通過與對(duì)照品比較保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜信息，該化合物鑒定為葡糖糖酸。

化合物2的 ［M－H］－＝133，該離子二級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生1個(gè)m／z＝115的碎片離子，為失去1分子H2O所致，該化合物在反相C18柱的保留也很弱，僅僅比葡糖糖酸稍強(qiáng)，通過與文獻(xiàn)比較，該化合物推測(cè)為蘋果酸。

化合物3的 ［M－H］－＝191，對(duì)該離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生m／z＝173和111的2個(gè)碎片離子，其中m／z＝173為失去1分子H2O所致，通過與對(duì)照品比較保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜信息，該化合物鑒定為檸檬酸。

化合物4的 ［M－H］－＝153，對(duì)該離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生1個(gè)m／z＝109的碎片離子，為失去1分子CO2所致，通過與對(duì)照品比較保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜信息，該化合物鑒定為原兒茶酸。

化合物5的 ［M－H］－＝197，對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生m／z＝179、135和73的碎片離子，碎片離子m／z＝179為失去1分子H2O所致，碎片離子m／z＝135為失去1分子H2O和1分子CO2所致，由于缺乏對(duì)照品和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，該化合物無法得到結(jié)構(gòu)推測(cè)和鑒定。

化合物6的 ［M－H］－＝137，該離子二級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生1個(gè)m／z＝109的碎片離子，為失去1分子CO所致，該化合物在反相C18柱的保留比原兒茶酸稍弱，具有與原兒茶酸相似的裂解規(guī)律，通過與文獻(xiàn)比較，推測(cè)為原兒茶醛。

化合物7的 ［M－H］－＝325，對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生m／z＝307和187的碎片離子，碎片離子m／z＝307為失去1分子H2O所致，由于缺乏對(duì)照品和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，該化合物無法得到結(jié)構(gòu)推測(cè)和鑒定。

化合物8的 ［M－H］－＝179，該離子二級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生1個(gè)m／z＝135的碎片離子，為失去1分子H2O所致，通過與對(duì)照品比較保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜信息，該化合物鑒定為咖啡酸。

化合物9的 ［M－H］－＝521，該離子的二級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生1個(gè)m／z 359的離子碎片，其在反相C柱的保留比迷迭香酸 （化合物10）稍弱，通過與文獻(xiàn)比較，該化合物推測(cè)為異迷迭香酸苷。

圖1 夏枯草水提液的HPLC－ESI－MS色譜圖

表1 夏枯草水提液的化學(xué)成分鑒定 （%）

化合物10的 ［M－H］－＝359，該離子二級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生m／z＝223、197、179、161和133的碎片離子，通過與對(duì)照品比較保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜信息，該化合物鑒定為迷迭香酸。

4 結(jié)論

色譜圖中的相對(duì)峰面積大小代表了其相對(duì)應(yīng)化合物含量的高低，本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明夏枯草水提液中含量最高的三個(gè)化合物分別為迷迭香酸 （32.1%）、檸檬酸（14.8%）和咖啡酸 （13.5%），這3個(gè)物質(zhì)均為有機(jī)酸類化合物，夏枯草水提液中所含的其它有機(jī)酸類化合物還有葡糖 糖 酸 （8.2%）、蘋 果 酸 （3.9%）和 原 兒 茶 酸（1.8%），有機(jī)酸類化合物的含量占了總含量的74.3%，由此可見，夏枯草水提液的主要活性成分為有機(jī)酸類化合物。另外還有一定含量的原兒茶醛 （6.6%）和異迷迭香酸苷 （10.6%）。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為夏枯草的活性成分研究和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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