陳瑞愛，羅 瓊，郭 凱，劉正偉，王亞欣

(1．廣東省獸用生物制品生物技術(shù)研究與應(yīng)用企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東肇慶 526238;2．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510000)

馬立克氏病(Marek’s disease，MD)是雞常見的一種淋巴細(xì)胞增生性疾病，該病由馬立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV)引起，具有高度傳染性。該病以外周神經(jīng)、生殖腺、各個(gè)臟器、肌肉、皮膚中單核細(xì)胞浸潤(rùn)以及由于外周神經(jīng)腫瘤細(xì)胞的集聚而引起的半癱瘓或完全癱瘓為典型特征，引起多種功能障礙并可導(dǎo)致被感染雞產(chǎn)生腫瘤和死亡，在未免疫雞群可造成很高的發(fā)病率和死亡率［1－2］。

MDV可分為3個(gè)血清型，血清Ⅰ型(MDV－1)包括致瘤型的MDV及其一些致弱的疫苗毒株;血清Ⅱ型(MDV－2)為非致瘤性的自然弱毒株;血清Ⅲ型(MDV－3)為最早用作疫苗毒的火雞皰疹病毒(HVT)，無致瘤性［3－5］。目前廣泛使用的傳統(tǒng)疫苗也存在著許多的不足之處，免疫M(jìn)D疫苗并不能消除雞體內(nèi)的病毒，免疫雞仍然可以攜帶強(qiáng)毒并向環(huán)境中排毒，據(jù)研究，這種情況可能是導(dǎo)致MDV毒力不斷增強(qiáng)的重要原因［6－7］。為了更好的了解雞場(chǎng)中MD的流行規(guī)律及病毒的分子特征，對(duì)野毒株進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)這些致病相關(guān)基因進(jìn)行序列分析是十分必要的。長(zhǎng)期以來，MDV基因組研究一直缺乏快速、方便可靠的病毒DNA操作方法，基于細(xì)菌人工染色體(Bacterial artificial chromosome，BAC)系統(tǒng)的MDV感染性克隆的成功構(gòu)建使MDV分子水平上的操作變的簡(jiǎn)單可行［8－9］。

實(shí)驗(yàn)室于2009年在中國(guó)廣東已經(jīng)免疫M(jìn)D疫苗的種雞場(chǎng)分離了一株MDV，命名為GD0908株并利用BAC技術(shù)，構(gòu)建了GD0908株的感染性克隆rGD0908，為MDV基因組學(xué)及其致病機(jī)理的研究提供了技術(shù)平臺(tái)。

1 材料與方法

1．1 毒株 GD0908株，于2009年由本實(shí)驗(yàn)室分離自廣東省某雞場(chǎng)發(fā)生腫瘤的40周齡三黃種雞，該雞群已用 CVI988/Rispens株 MDV疫苗免疫，CVI988株為MDV I型弱毒株，頸部皮下免疫1羽份(不低于3000 PFU)，仍有超過5%的腫瘤發(fā)生率。GD0908株的分離過程如下:無菌操作采集病雞的全血，加入抗凝劑(3．5%檸檬酸鈉)后搖勻，分離外周血淋巴細(xì)胞后接種長(zhǎng)成單層的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，置37℃ 和5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 d后出現(xiàn)明顯的MDV蝕斑，雞胚成纖維細(xì)胞(Chicken embryo fibroblast，CEF)同時(shí)未發(fā)現(xiàn)其它已知病毒。該毒株經(jīng)噬斑克隆后利用間接免疫熒光［10］證實(shí)為 MDVⅠ型病毒，將該毒株命名為GD0908株。通過SPF雞的人工感染實(shí)驗(yàn)確定了GD0908株的致病性，并驗(yàn)證了其毒力(病理組織學(xué)病變率為97．5%(39/40))較國(guó)內(nèi)的J－1株強(qiáng)(病理組織學(xué)病變率87．5%(35/40))(未發(fā)表數(shù)據(jù))。

1．2 菌株與質(zhì)粒 DH10B大腸桿菌用來構(gòu)建BAC克隆的宿主菌，由本實(shí)驗(yàn)室保存。含有BAC骨架用于同源重組的質(zhì)粒pUS2－BAC－gpt為本實(shí)驗(yàn)室保存(圖1)，重組質(zhì)粒在MDV US2同源臂序列之間加入了BAC骨架、氯霉素抗性基因及gpt篩選基因。

圖1 pUS2-BAC-gp t質(zhì)粒示意圖

1．3 相關(guān)試劑 DMEM、轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine及新生牛血清，Invitrogen公司。PCR反應(yīng)試劑、限制性內(nèi)切酶、DL2000、DL15000 marker和 rTaq酶，大連TaKaRa公司;凝膠回收試劑盒、QIAGEN plasmid Mini kit、QIAGEN plasmid Midi kit，QIAGEN 公司;氯霉素及氨芐青霉素，Amresco公司。霉酚酸(MPA)、黃嘌呤(xanthine)、次黃嘌呤(hypoxanthine)、FITC標(biāo)記的抗鼠IgG二抗，Sigma公司。

1．4 重組病毒的構(gòu)建

1．4．1 轉(zhuǎn)染 CEF細(xì)胞 按常規(guī)方法提取感染GD0908的CEF細(xì)胞基因組DNA，取1μg上述提取的 DNA與2．5μg pUS2－BAC－gpt質(zhì)粒 DNA共同轉(zhuǎn)染原代CEF［7］，轉(zhuǎn)染后，在37℃﹑5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，等待噬斑出現(xiàn)

1．4．2 接種培養(yǎng) 轉(zhuǎn)染6 d后，將轉(zhuǎn)染出的病變細(xì)胞整孔用PBS洗兩遍，用0．05%的胰酶消化，接種到含有8×106個(gè)CEF的T75細(xì)胞瓶中，接種前1 h在上述細(xì)胞瓶培養(yǎng)基中加入250μg/mL霉酚酸，50μg/mL黃嘌呤及 100μg/mL次黃嘌呤，37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，5 d后將感染的CEF消化下來再次接種于含有篩選培養(yǎng)基的CEF中，如此反復(fù)進(jìn)行4次，用以提高發(fā)生同源重組產(chǎn)生的MDV的濃度，待出現(xiàn)60%的細(xì)胞病變時(shí)，將細(xì)胞消化，提取細(xì)胞基因組 DNA［8］。

1．5 BAC分子克隆化病毒的獲得 取1．4中所述收獲的感染GD0908株的CEF細(xì)胞基因組DNA 1μg與50μL DH10B感受態(tài)細(xì)胞于預(yù)冷的0．1 cm電轉(zhuǎn)化杯中，在2000 V，100Ω，25μF的條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。電擊后迅速加入1 mL預(yù)熱至37℃的SOC液體培養(yǎng)基，置于37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)2 h后，取200μL涂布于含25μg/mL的氯霉素的LB選擇性瓊脂平板放置于37℃溫箱過夜培養(yǎng)，挑取平板上單菌落接種于500 mL，含250μg/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)16 h。將培養(yǎng)16 h后的500 mL菌液用QIAGENE plasmid Midi kit試劑盒按其說明操作，中量提取BAC質(zhì)粒。BACDNA的提取按照試劑盒說明書進(jìn)行，將提取的大分子量BAC DNA去1μg用限制性內(nèi)切酶Bam H I 1μL及Eco R I 1μL，37℃酶切2 h后做普通的電泳分析。同時(shí)PCR擴(kuò)增gpt基因以及MDV毒株的meq基因、US10基因和pp38基因，相關(guān)引物見表1。50μL PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系具體成分:10×擴(kuò)增緩沖液 5μL，dNTPs各0．8 mmol/L，引物各 0．5 μmol/L，模板 DNA 120 ng，Taq DNA 聚合酶2．5 μL，Mg2+3．2 mmol/L，用水補(bǔ)齊至50μL，將上述成分分別加入PCR擴(kuò)增試劑到PCR管中，輕輕混和均勻后，離心后置于PCR擴(kuò)增儀。按照以下擴(kuò)增程序進(jìn)行反應(yīng)。首輪循環(huán):95℃5 min，54℃ 1 min，72℃ 1 min;中間循環(huán):95℃1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);末輪循環(huán):95℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃延伸10 min;末輪循環(huán)后置4℃保存。

表1 用PCR來鑒定GD0908-BAC所用的部分引物

1．6 重組病毒的拯救及間接免疫熒光試驗(yàn) 按照轉(zhuǎn)染試劑 LipfectamineTM2000的說明，取 Qiagen Plasmid Midi Kit試劑盒提取的經(jīng)鑒定的BAC DNA1μg于 100μL opti－MEM 中，取 10μL lipfectamine于100μL opti－MEM中，將兩者混勻，室溫放置20 min后，用opti－MEM補(bǔ)充至1 mL后加入6孔板中置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，然后將該6孔板中的液體換為含5%犢牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)幾天，當(dāng)病毒蝕斑形成后，用500μL 0．25%胰酶37℃、2 min將細(xì)胞消化，傳至已長(zhǎng)成單層的原代CEF，如此連續(xù)傳34代以擴(kuò)大病毒量，待擴(kuò)增到一定量時(shí)，將其收獲，凍存于液氮中。次日，取出1支進(jìn)行病毒定量。將100 PFU病毒rGD0908株接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上已鋪成單層的CEF中。培養(yǎng)3 d后，將生長(zhǎng)液倒掉，用冷丙酮∶乙醇(3∶2)固定液固定5 min，用PBS洗1次，加0．5 mL(1∶100稀釋)抗MDV抗體，放37℃溫箱反應(yīng)45 min后，用PBS洗3次，將水分甩干，加上FITC標(biāo)記抗鼠IgG熒光抗體(sigma，按說明書配置工作濃度)0．5 mL，放37℃溫箱反應(yīng)45 min后，用PBS洗3次，將水分甩干，加1滴50%甘油，在倒置熒光顯微鏡下觀察(200×)。

1．7 重組病毒體外生長(zhǎng)特性測(cè)定 為了判定rGD0908株在細(xì)胞中的增殖速率，將GD0908株與rGD0908株按100PFU/孔的量分別接種5塊鋪滿CEF 單層的6 孔板中，在24、48、96、120、144 h 時(shí)分別取1塊6孔板，測(cè)定每孔的病毒滴度，計(jì)算平均值，繪制病毒的生長(zhǎng)曲線，比較 GD0908株與rGD0908株在CEF上的生長(zhǎng)速率差異。

2 結(jié)果

2．1 BAC分子克隆化病毒的鑒定結(jié)果 利用Qiagen Plasmid Midi Kit試劑盒提取rGD0908質(zhì)粒，用Eco RⅠ和Bam HⅠ進(jìn)行酶切，酶切結(jié)果見圖2A;以rGD0908株DNA為模板，以表1中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖 2B，結(jié)果表明，以rGD0908株BAC克隆為模板，gpt基因以及GD0908株基因組中的meq、US10、pp38均獲得了特異性的擴(kuò)增。酶切及PCR結(jié)果證實(shí)了獲得的克隆為rGD0908株陽(yáng)性克隆。

圖2 鑒定GD0908株BAC質(zhì)粒的結(jié)果

2．2 拯救的重組病毒鑒定 用Qiagen Plasmid Midi Kit試劑盒提取 BAC DNA，按照轉(zhuǎn)染試劑LipfectamineTM2000的說明，取 1μg質(zhì)粒與 10μL Lipfectamine轉(zhuǎn)染CEF。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)5 d出現(xiàn)病毒蝕斑，該傳染性克隆病毒定名為rGD0908株。在接種rGD0908株的CEF單層上，用抗MDVⅠ特異血清進(jìn)行IFA檢測(cè)，結(jié)果呈現(xiàn)出顯示熒光的特異性病毒蝕斑，而作為對(duì)照的沒有接種MDV的CEF沒有顯示熒光(圖3)。

圖3 重組病毒rGD0908的噬斑形態(tài)

2．3 GD0908株與rGD0908株在體外增殖能力比較 為了確定rGD0908株在體外的復(fù)制能力，利用rGD0908株與父代病毒GD0908株同時(shí)感染CEF，進(jìn)行病毒生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示，rGD0908株與GD0908株在體外增殖速度無顯著性差異(圖4)。

圖4 GD0908株和rGD0908株在CEF上的增殖曲線

3 討論

近50年來，對(duì)MDV的研究取得了突破性進(jìn)展，在這一過程中，現(xiàn)有的MDV疫苗雖然很好的控制了MD的發(fā)生，但其并不能控制MDV的感染與傳播(GD0908株即為CVI988疫苗免疫雞群中分離的)，還直接導(dǎo)致了MDV毒力的不斷增強(qiáng)［6］。按照MDV演變規(guī)律，其毒力很有可能會(huì)在今后幾年變得更強(qiáng)［11］，如果到時(shí)沒有獲得有針對(duì)性的疫苗，MDV可能給養(yǎng)禽業(yè)帶來一場(chǎng)新的災(zāi)難。要獲得良好MD疫苗還有許多工作去做，比如，目前仍沒有完全弄清哪些基因與免疫原性或毒力有關(guān)，如RLORF5 a能在腫瘤細(xì)胞系及MDV潛伏感染的QT35腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)，但它的表達(dá)對(duì)潛伏感染和病毒復(fù)制或腫瘤轉(zhuǎn)化的重新激活是非必須的［12－15］;作為一個(gè)高效的疫苗，哪些基因必須表達(dá)(或敲除);另外，對(duì)MDV的先天性與獲得性免疫以及疫苗的保護(hù)機(jī)理仍然沒有搞清楚［16－18］;同時(shí)，對(duì)介導(dǎo) MDV 感染與傳播的基因也需要進(jìn)行深入的研究［19－20］。

由于MDV基因組比較大，一直以來，MDV的基因突變、基因缺失等分子水平上的操作比較困難，BAC技術(shù)有力的推動(dòng)了MDV的基因組學(xué)研究。1997年，Messerle首次將BAC克隆及突變技術(shù)運(yùn)用在基因組為220 kb的鼠細(xì)胞巨化病毒的基因上［21］，成功地將傳染性皰疹病毒的全基因組作為mini－F質(zhì)粒克隆進(jìn)大腸桿菌。2000年，BAC技術(shù)開始運(yùn)用于MDV感染性克隆的構(gòu)建，Schumacher等成功地獲得了無致病力的584Ap80C的感染性克?。?］。此后，國(guó)內(nèi)外學(xué)者基于BAC技術(shù)構(gòu)建了一系列的MDV感染性克隆，包括疫苗株及強(qiáng)毒株［22－25］，并在此基礎(chǔ)上對(duì)MDV進(jìn)行了多個(gè)基因功能的研究(如 Meq、PP38、1．8kb mRNA、vIL －8 等)和重組疫苗的。本研究把GD0908株的基因組克隆入BAC中，自大腸桿菌中提取的BAC DNA經(jīng)轉(zhuǎn)染CEF后成功拯救出了重組病毒rGD0908株。拯救的病毒利用MDVⅠ特異性抗體進(jìn)行IFA檢測(cè)進(jìn)一步證明了GD0908株的感染性克隆的成功構(gòu)建。該技術(shù)允許MDV基因組以BAC形式在大腸桿菌(E．coli)中保存、增殖和引入人工突變。理論上，它允許對(duì)病毒基因組中任何基因進(jìn)行各種修飾，包括基因的剪切﹑插入﹑突變﹑克隆與亞克隆等，并且操作非常方便。該技術(shù)為研究病毒的復(fù)制、生長(zhǎng)特性、致病性、病毒與宿主之間的相互關(guān)系等提供了一個(gè)嶄新而高效的手段。因此，基于BAC系統(tǒng)的MDV感染性克隆的成功構(gòu)建使MDV分子水平上的操作變的非常簡(jiǎn)單可行，也將會(huì)極大的促進(jìn)MDV分子致病機(jī)理的研究進(jìn)程，同時(shí)，BAC技術(shù)也為皰疹病毒編碼的microRNA 研究提供了便利［26－27］，利用同源重組技術(shù)構(gòu)建microRNA單基因或單基因簇敲除的毒株，可為進(jìn)一步研究microRNA基因缺失對(duì)MDV的復(fù)制、致病性、致瘤性等致病表型的影響及其分子調(diào)控機(jī)制奠定良好的基礎(chǔ)。

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