王秀麗，程君生，毛開榮，丁家波，蔣玉文

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌引起的一種重要的人獸共患傳染性變態(tài)反應(yīng)疾病，被列為《家畜家禽防疫管理條例實(shí)施細(xì)則》中二類傳染病之首［1］，也是OIE規(guī)定的必須上報的傳染病之一，已引起醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)界的廣泛重視。布魯氏菌的抗原組成比較復(fù)雜，其毒力與外膜中的脂多糖蛋白復(fù)合物有關(guān)已經(jīng)被證實(shí)。脂多糖(LPS)是布魯氏菌的主要毒力因子，也是主要的抗原表位。光滑型(S型)布魯氏菌毒力明顯高于粗糙型(R型)，R型布魯氏菌表面缺乏S型的LPS，故R型為低毒或無毒株［2］，所以在檢測布魯氏菌病時主要針對光滑型致病株引起的感染。目前用于布魯氏菌病診斷的血清學(xué)方法如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)［3－4］、膠體金免 疫 層 析 法 (GICA)［5］、膠 體 金 免 疫 滲 濾 法(GIDFA)［6］、熒光偏振試驗(FPA)［7－9］等都是以LPS為診斷抗原，但LPS的純化研究報道較少，因此提高基于LPS抗原的布魯氏菌病檢測方法的穩(wěn)定性和特異性，更準(zhǔn)確確定各種檢測方法所用LPS抗原的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及提高檢測方法的敏感性，LPS的純化具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑 羊種布魯氏菌16M(CVCC 70002)由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存。消化用蛋白酶K由Sigma公司提供。其他化學(xué)試劑均為北京化工廠分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 布魯氏菌LPS抗原的粗提取 將布魯氏菌16M的純培養(yǎng)物經(jīng)80℃滅活4 h后8000 g離心10 min，棄上清，加入生理鹽水重懸，離心，反復(fù)洗滌3次。參照OIE手冊介紹的方法［10］，取50 g濕菌體，加入170 mL蒸餾水，混勻后加熱至66℃，后加入190 mL 66℃的90%(V/V)的苯酚溶液，在66℃攪拌15 min，4℃ 10000 g離心15 min，用長針頭移取位于下層的酚相;加入500 mL含1%飽和醋酸鈉的冷甲醇沉淀LPS，4℃沉淀2 h后10000 g離心15 min，棄去上清，沉淀中加入80 mL蒸餾水，4℃攪拌18 h，10000 g離心10 min后收集上清，沉淀中繼續(xù)加入80 mL蒸餾水，4℃攪拌2 h后10000 g離心15 min，上清與前面的上清合并;在160 mL上清中加入8 g三氯乙酸，攪拌10 min后10000 g離心取上清，用蒸餾水透析，4000 mL/次，每次透析3 h，透析4次。

1.2.2 粗提取LPS的鑒定及純度檢測 粗提LPS銀染鑒定。銀氨染色法可以用于脂多糖的鑒定，布魯氏菌LPS銀氨染色結(jié)果在3050 kD之間有連續(xù)的棕黃色條帶［4］，操作如下:將粗提取的 LPS經(jīng)SDS－PAGE后，用含0.7%的高碘酸，40%無水乙醇，5%無水乙酸的固定液200 mL于22℃氧化固定20 min，用滅菌純水漂洗3次，5 min/次;將4 mL的NH3H2O和56 mL 1.0 mol/L的NaOH與200 mL的滅菌純水混合，逐滴加入20%AgNO3溶液10 mL，邊加邊攪拌，用滅菌純水定容至300 mL，以配好的染色液染色10 min，滅菌純水漂洗3次，5 min/次;將0.01 g的檸檬酸溶解于200 mL的滅菌純水，加入0.1 mL 37%的甲醛溶液，用已配好的顯影液顯影10 min，用10%的乙酸作用1 min終止顯色。LPS被染成棕黃色的連續(xù)條帶。

粗提取LPS的純度鑒定。將粗提取的LPS用瓊脂糖凝膠電泳檢測殘留核酸，經(jīng)SDS－PAGE、考馬斯亮藍(lán)染色檢測殘留雜蛋白。

1.2.3 粗提LPS的純化 硫酸銨沉淀純化法:在20 mL粗提取的LPS中逐滴加入飽和硫酸銨溶液，使得殘留的雜蛋白在合適的硫酸銨濃度下析出，離心去除沉淀，用去離子水充分透析，除去硫酸銨。

冷甲醇二次沉淀純化法:將含1%飽和醋酸鈉溶液的冷甲醇逐滴加入20 mL粗提取的LPS中，邊加邊攪拌，至加入LPS體積的3倍，于4℃靜置2 h，10000 g離心10 min，沉淀用20 mL滅菌純水重懸。

酶消化處理純化法:在20 mL粗提的LPS中加入終濃度15 μg/mL的核酸酶或蛋白酶K，加入核酸酶后37℃消化24 h，加入蛋白酶K后55℃消化3 h，然后室溫消化24 h。用去離子水充分透析，將消化后的小分子雜質(zhì)透析掉。

1.2.4 不同純化方法的純化效果比較 將硫酸銨沉淀法、冷甲醇二次沉淀法、酶消化處理法純化的LPS均恢復(fù)至20 mL，用銀氨染色法定性比較以上三種純化方法純化的LPS抗原的產(chǎn)率，iELISA定性比較不同純化方法的活性，用瓊脂糖凝膠電泳和SDS－PAGE鑒定LPS的純度。

1.2.5 純化工藝的重復(fù)性研究 選擇一種較好的純化方法，按照確定的提純工藝分三次提取布魯氏菌16M的LPS抗原，用銀氨染色法鑒定不同批次純化的LPS，用iELISA鑒定不同批次純化的LPS的活性。

2 結(jié)果

2.1 布魯氏菌LPS抗原的粗提取及鑒定 參照OIE手冊制備的LPS經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測不到核酸條帶，經(jīng)SDS－PAGE垂直電泳后考馬斯亮藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)有雜蛋白存在(圖1)，SDS－PAGE垂直電泳后銀氨染色結(jié)果顯示在30～50 kD處有染成棕黃色的連續(xù)條帶(圖2)。與文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致。

圖1 LPS經(jīng)蛋白酶K消化前后的SDS－PAGE電泳后考馬斯亮藍(lán)染色圖

圖2 不同批次提取LPS在消化前和消化后的銀染圖

2.2 LPS不同純化方法的純化效果比較 硫酸銨沉淀法試驗結(jié)果顯示由于提取的LPS中蛋白的含量較低，硫酸銨無法將其有效沉淀出來，而且由于加入較高濃度的硫酸銨，透析時會使LPS的體積大量增加，濃度降低，增加了污染的機(jī)會，需要增加一步濃縮的步驟。因此此純化方法被放棄。

冷甲醇二次沉淀純化的LPS SDS－PAGE電泳后考馬斯亮藍(lán)染色檢測不到雜蛋白，說明純度能滿足要求，但銀氨染色結(jié)果顯示著色較淺(圖4)，說明在純化的過程中有大量的LPS丟失，LPS的產(chǎn)率不高。

粗提取的LPS鑒定結(jié)果顯示無核酸殘留，于是只加入終濃度為15 μg/mL的蛋白酶K消化，將消化產(chǎn)物透析后，考馬斯亮藍(lán)染色檢測不到雜蛋白(圖1)，說明LPS的純度較高。而蛋白酶K消化前和消化后銀染圖顯示消化過程對LPS的影響不大(圖2)，消化后透析前和透析后LPS的銀染結(jié)果也無明顯差異，說明透析過程不會導(dǎo)致LPS的明顯損失(圖3)。

酶消化處理純化的LPS與冷甲醇二次沉淀的LPS的活性檢測采用iELISA定性分析，結(jié)果顯示，酶消化處理的LPS的活性明顯比冷甲醇純化的LPS活性高(表1)，酶消化處理純化的LPS在稀釋至28時檢測陽性血清的OD450mm仍較高，而冷甲醇二次沉淀的 LPS在23稀釋時檢測陽性血清的OD450mm值已經(jīng)較低，證明酶消化處理的LPS活性比冷甲醇沉淀的活性高，且酶消化處理的整個過程LPS的活性不會降低(表1)。

綜合比較各純化方法純化抗原的純度、產(chǎn)率、活性，結(jié)果證明酶消化處理純化LPS的效果較好。不同純化方法純化效果比較見表2。

表1 不同抗原稀釋倍數(shù)LPS的活性分析結(jié)果(OD450mm)

表2 不同純化階段LPS的檢測結(jié)果

表3 3批LPS不同稀釋倍數(shù)活性比較(OD450mm)

2.3 LPS提純工藝的重復(fù)性試驗 參照OIE手冊并根據(jù)1.2.2項試驗的結(jié)論，按照確定的LPS的粗提取和純化工藝分三次提取布魯氏菌16M的LPS抗原，對三批抗原進(jìn)行純度和活性檢測，三批LPS的銀染鑒定結(jié)果見圖2，三批LPS的活性測定結(jié)果見表3，試驗結(jié)果證明此提純工藝的可重復(fù)性良好。

3 討論

本研究比較了硫酸銨沉淀法、冷甲醇沉淀法和酶消化處理法純化LPS的效果。結(jié)果顯示:因雜蛋白的含量較低，硫酸銨不能有效沉淀雜蛋白。LPS銀染和活性測定結(jié)果證明冷甲醇二次沉淀純化LPS產(chǎn)率較低;而酶消化處理法操作簡便并且產(chǎn)率高;本研究定性分析了冷甲醇沉淀法和酶消化處理法純化的LPS的活性，結(jié)果顯示酶消化處理的LPS活性明顯比冷甲醇沉淀的活性高，所以選擇酶處理方法用于LPS的純化。

本研究通過試驗和分析，參照了OIE手冊并進(jìn)行了適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)，提純的LPS經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后無核酸條帶，SDS－PAGE電泳后考馬斯亮藍(lán)染色無蛋白條帶，銀氨染色在3050 kD之間有一條棕黃色連續(xù)的顯色帶［4－5］;按照確定的純化工藝分三次獨(dú)立提取布魯氏菌16M中的LPS抗原，并用SDSPAGE電泳后考馬斯亮藍(lán)染色和銀氨染色鑒定了LPS的純度，用iELISA定性分析三批LPS的生物活性，試驗結(jié)果證明此改良的提純方法可重復(fù)性良好。純化的LPS稀釋3200倍仍能有效檢出布魯氏菌IgG抗體，也證明LPS抗原用于布魯氏菌病IgG抗體的檢測非常靈敏。

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