周井祥，王 好，呂文亮，李新偉

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，長(zhǎng)春 130118)

錦鯉皰疹病毒病(Kio herpesvirus disease，KHVD)是由錦鯉皰疹病毒(Kio herpesvirus，KHV)引起錦鯉、鯉魚及其普通變種如框鏡鯉發(fā)病的一種具有高度傳染性和致死性的疾病。該病于1998年首次在以色列的 Magan Michael地區(qū)和美國(guó)爆發(fā)［1］，2000年該病在中國(guó)廣東省錦鯉疑似發(fā)生本病［2］。該病在我國(guó)的鯉魚養(yǎng)殖中發(fā)病較多，造成鯉魚的大量死亡，給鯉魚養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大經(jīng)濟(jì)損失。KHV是線形雙股DNA病毒，是魚類皰疹病毒屬中基因組最大的病毒［3］。目前，Genbank已經(jīng)公布了三株分別來(lái)自日本、美國(guó)和以色列錦鯉皰疹病毒的基因序列［4］，基因組大小為295 kbp，并含有22 kbp的末端同向重復(fù)序列;有156個(gè)開放性閱讀框(ORF)，8個(gè)末端重復(fù)序列。KHV的156個(gè)ORF的功能只有少數(shù)已經(jīng)確定其功能。研究較多的ORF25、ORF81和ORF83基因主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)［5］，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。研究還對(duì)ORF25、ORF81和ORF83基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析［6－8］;Agus Sunarto 等［9］克隆了編碼白細(xì)胞介素－10(ORF134基因)并對(duì)其功能進(jìn)行了分析;Takashi Aoki等［10］制備了針對(duì) KHV ORF68 基因的單克隆抗體;Murwantoko等克隆了KHV膜糖蛋白基因ORF124并對(duì)其進(jìn)行了表達(dá)，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行了部分生物學(xué)信息分析，ORF124基因預(yù)測(cè)分析表明:主要表達(dá)膜糖蛋白，可具有良好的免疫原性，產(chǎn)生中和性抗體，可作為制備疫苗的候選基因［11］。

研究以實(shí)驗(yàn)室在國(guó)內(nèi)首次分離到的錦鯉皰疹病毒吉林株(KHV－CJ株)基因組為模板，克隆KHV膜蛋白ORF124基因，并分析其生物學(xué)信息，旨在為我國(guó)錦鯉皰疹病毒的基因背景信息，發(fā)病機(jī)理，分子流行病學(xué)及基因工程疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞與病毒 錦鯉皰疹病毒中國(guó)吉林株(KHV－CJ株)由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存［12］;錦鯉皰疹病毒尾鰭原代細(xì)胞由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室繁殖保存。

1．2 菌株與載體 pMD18－T載體購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，E．coli DH5α，北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1．3 主要試劑 新生牛血清(批號(hào)1076962)、M199培養(yǎng)基(批號(hào) 1098911)，GBICO公司;Ex Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ和Eco RⅠ、10×ExBuffer(批號(hào) AA7701A)、dNTP Mix(批號(hào)BG8601A)、DNA Marker，大連寶生物工程有限公司;DNA膠回收試劑盒(批號(hào)I8110)，天跟生化有限公司;質(zhì)粒小提試劑盒(批號(hào)20100916)，北京索來(lái)寶科技有限公司。

1．4 引物的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank上登錄的錦鯉皰疹病毒 ORF124基因序列，利用 Primer Premier 5．0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物，P1:5'－GAATTCATGGGACCTTTGACCATCTA －3'，P2:5'－GGATCCTCACTTGAGCTCGCC －3'，分別引入 Eco RⅠ和Bam HⅠ限制性酶切位點(diǎn)(劃線部位)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1．5 KHV－CJ株ORF124基因的 PCR擴(kuò)增 按照 Hasegawa［13］和 Neukirch［14］的方法培養(yǎng)細(xì)胞。將實(shí)驗(yàn)室保存的KHV－CJ株病毒液反復(fù)凍融三次后，取1 mL與MFC細(xì)胞單層在22℃的條件下共培養(yǎng)。逐日觀察細(xì)胞病變情況，收集細(xì)胞病變達(dá)70%80%的細(xì)胞及上清液，用堿裂解法提取病毒DNA，用于PCR特異性擴(kuò)增。采用25μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件如下:95℃5 min;94℃40 s，59 ℃30 s，72 ℃1 min，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min，反應(yīng)結(jié)束后4℃保存。

1．6 KHV－CJ株ORF124基因的克隆及鑒定 用凝膠回收試劑盒將目的片段純化回收后，與pMD18－T載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上篩選單菌落，接種于含0．1 mg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，200 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取重組質(zhì)粒，以Eco RⅠ和Bam HⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒。篩選出的陽(yáng)性質(zhì)粒送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1．7 KHV－CJ株ORF124基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析 利用DNAStar軟件翻譯出ORF25基因的核苷酸序列;利用 SingalPv 3．0(http://www．cbs．dtu．dk/services/SignalP/)軟件進(jìn)行氨基酸序列的信號(hào)肽分析;利用 TMHMM Server v．2．0(http://www．cbs．dtu．dk/services/TMHMM/)軟件進(jìn)行跨膜區(qū)分析;利用 ProtScale(http://www．expasy．ch/tools/protscale．html)軟件分析蛋白的疏水性;利用BepiPred 1．0 Server(http://www．cbs．dtu．dk/services/BepiPred/)軟件和 DNAStar 6．0(Protean)對(duì)ORF124序列編碼的蛋白進(jìn)行抗原表位分析;分別利用 NetNGlyc 1．0(http://www．cbs．dtu．dk/services/NetNGlyc/)和 YinOYang 1．2(http://www．cbs．dtu．dk/services/YinOYang/)在線分析軟件進(jìn)行N－糖基化位點(diǎn)和O－糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，利用NetPhos 2．0(http://www．cbs．dtu．dk/services/Net-Phos/)進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

2．1 ORF124基因的PCR擴(kuò)增和鑒定 從細(xì)胞毒中提取KHV－CJ株總DNA后，經(jīng)PCR擴(kuò)增出一條與目的片段大小相符的DNA片段(見圖1)。將目的片段純化回收后，與pMD18－T載體連接，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選后，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ和，Bam HⅠ進(jìn)行雙酶切，獲得一段約846 bp的片段(見圖2)，說(shuō)明ORF124基因片段已成功克隆至載體中。測(cè)序結(jié)果表明:KHV－CJ株與日本株、美國(guó)株、以色列株同源性均為99%，證明克隆出KHV－CJ株ORF124基因。

圖1 錦鯉皰疹病毒KHV-CJ株ORF124基因的PCR擴(kuò)增

2．2 HV－CJ株ORF124基因的生物信息學(xué)分析

2．2．1 錦鯉皰疹病毒 KHV－CJ株 ORF124基因的序列結(jié)果和編碼蛋白質(zhì)分子特征 測(cè)序結(jié)果表明，ORF124基因長(zhǎng)846 bp，為一完整的開放閱讀框，編碼281個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)ORF124基因的理論分子質(zhì)量為31221．96 Da，等電點(diǎn)為8．158，含有27 個(gè)強(qiáng)堿性氨基酸(K、R)、25個(gè)強(qiáng)酸性氨基酸(D、E)、93 個(gè)疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)、80 個(gè)極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)。

圖2 KHV-CJ株ORF124基因的雙酶切鑒定

2．2．2 KHV－CJ株ORF124基因的信號(hào)肽分析

將測(cè)得的ORF124氨基酸序列在丹麥技術(shù)大學(xué)生物序列分析中心(CBS)的網(wǎng)站 http://www．cbs．dtu．dk/services/SignalP進(jìn)行在線分析，通過(guò)Singal-Pv3．0進(jìn)行信號(hào)肽切割位點(diǎn)的預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示(圖3)，信號(hào)肽切割部位最可能位于24位的T(蘇氨酸)和25位的V(纈氨酸)氨基酸之間。

圖3 KHV-CJ株ORF124基因的信號(hào)肽預(yù)測(cè)

2．2．3 KHV－CJ株ORF124基因的跨膜區(qū)分析

TMHMM預(yù)測(cè)ORF124沒(méi)有跨膜區(qū)(圖4)。

圖4 KHV-CJ株ORF124基因的跨膜區(qū)分析

2．2．4 KHV－CJ株ORF124基因的疏水性分析

通過(guò)ProtScale在線分析，ORF124基因的最大疏水指數(shù)為2．189，最小疏水指數(shù)為 －0．567，其疏水性分析結(jié)果(圖5)。

圖5 KHV-CJ株ORF124基因的疏水性分析

2．2．5 KHV－CJ株ORF124基因的抗原表位分析

用 http://www．cbs．dtu．dk/services/BepiPred/在線軟件及 DNAStar6．0(Protean)對(duì)錦鯉皰疹病毒ORF124基因編碼的蛋白進(jìn)行抗原表位分析，得出其抗原表位主要集中在第9～26、43～58、67～73、98 ～112、130 ～165、237 ～253、260 ～294、303 ～361、494～514、571～599、804～833位氨基酸(見圖6)。表明該蛋白的表面抗原決定簇位點(diǎn)區(qū)域廣泛，峰值高。預(yù)示KHV－CJ株ORF124基因可作為基因工程疫苗的重要候選基因。

圖6 KHV-CJ株ORF124基因的抗原表位分析

2．2．6 KHV－CJ株ORF124糖基化及磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè) 分別通過(guò)NetNGlyc 1．0在線分析軟件和YinOYang 1．2在線分析軟件對(duì) KHV－CJ株ORF124進(jìn)行N－糖基化位點(diǎn)和O－糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，其氨基酸序列不存在潛在的N－糖基化位點(diǎn)，11個(gè)潛在的O－糖基化位點(diǎn)。用NetPhos 2．0在線分析軟件對(duì) KHV－CJ株ORF124基因進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，當(dāng)閾值取0．5時(shí)，其氨基酸存在7個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)。

3 討論

錦鯉皰疹病毒病是由錦鯉皰疹病毒(Kio herpesvirus，KHV)引起的一種傳染性疾病，主要病癥是引起各生長(zhǎng)階段鯉魚、框鏡鯉、錦鯉因爛鰓而窒息死亡，死亡率高80100%，疫情難以控制，已引起各國(guó)的高度關(guān)注。2002年開始在我國(guó)傳播［3］，至今已遍布全國(guó)各地［5］，需要進(jìn)一步研究有效的疫苗，避免病毒的散播并消除病毒變異的可能，并填補(bǔ)目前國(guó)內(nèi)沒(méi)有有效疫苗的空白，控制KHV在我國(guó)暴發(fā)流行。而本研究選用KHV－CJ株ORF124基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研制基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

試驗(yàn)成功獲得了長(zhǎng)846 bp的ORF124基因，并使用Hidden Markov(HMM)模型對(duì)其信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)。信號(hào)肽是引導(dǎo)翻譯出的前體蛋白通過(guò)細(xì)胞膜分泌到胞外的一段序列，只有切除信號(hào)肽序列后前體蛋白才能進(jìn)入到分泌信號(hào)區(qū)，變成具有正常功能的成熟蛋白［15］，因此預(yù)測(cè)信號(hào)肽切割位點(diǎn)，可以對(duì)進(jìn)行表達(dá)研究的引物設(shè)計(jì)和真核及原核表達(dá)載體的構(gòu)建提供有價(jià)值的信息。另外，信號(hào)肽負(fù)責(zé)不同類蛋白質(zhì)的新生肽鏈的定位，信號(hào)肽的功能已不僅決定一個(gè)蛋白質(zhì)是否是分泌蛋白，而且和蛋白質(zhì)或其新生肽鏈在細(xì)胞內(nèi)的全方位定位有關(guān)［16］，對(duì)蛋白質(zhì)信號(hào)肽的分析具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。用Net-Phos 2．0在線分析軟件對(duì)KHV－CJ株ORF124基因進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)顯示，當(dāng)閾值取0．5時(shí)，其氨基酸存在7個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)。蛋白質(zhì)糖基化是一種重要的翻譯后修飾，約有一半以上的蛋白質(zhì)發(fā)生了糖基化，越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明:糖基化作為一種主要的翻譯后修飾對(duì)蛋白質(zhì)功能有著重要影響［17］，并可提高蛋白基因組的多樣性［18］，其中N－糖基化作用位點(diǎn)與抗原性和免疫原性有關(guān)［19］。

對(duì)錦鯉皰疹病毒ORF124基因編碼的蛋白進(jìn)行抗原表位分析，表明該蛋白的表面抗原決定簇位于區(qū)域廣泛而集中，峰值高。免疫細(xì)胞通常難以借助其表面受體識(shí)別整個(gè)蛋白質(zhì)抗原分子，而僅識(shí)別抗原肽分子上的一個(gè)特定部分即表位，又稱為抗原決定簇。因而表位代表了抗原分子上的一個(gè)免疫活性區(qū)，負(fù)責(zé)與抗體分子或免疫細(xì)胞表面的抗原受體結(jié)合，也是蛋白質(zhì)抗原性的基礎(chǔ)，正確而詳細(xì)地繪制蛋白質(zhì)表位圖譜，對(duì)定點(diǎn)改造蛋白質(zhì)分子，設(shè)計(jì)疫苗分子結(jié)構(gòu)及免疫干預(yù)治療等具有重要意義［20］。抗原表位分析表明:KHV－CJ株 ORF124基因優(yōu)于 KHV － CJ 株 ORF81、ORF83［9，11］，預(yù)示KHV－CJ株ORF124基因可作為基因工程疫苗的重要候選基因。

測(cè)序結(jié)果分析表明:KHV－CJ株ORF124基因與美國(guó)株、以色列株、日本株同源性均為99%，僅差一個(gè)堿基，但與美國(guó)株、以色列株表達(dá)氨基酸相同，與日本株不同。分別比對(duì) KHV－CJ株 ORF81、ORF25、ORF83、ORF124 四個(gè)基因［9－11］，進(jìn)化樹同源性上分析結(jié)果一致，進(jìn)一步說(shuō)明KHV－CJ株與歐美國(guó)家傳播的KHV具有同源性。

試驗(yàn)選用KHV的膜糖蛋白基因－ORF124基因作為目的基因，以在我國(guó)分離到的錦鯉皰疹病毒中國(guó)吉林株的DNA作為模板，成功將其克隆，并采用生物信息學(xué)方法對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了分析，為我國(guó)錦鯉皰疹病毒的基因背景信息、發(fā)病機(jī)理、分子流行病學(xué)及基因工程疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

［1］ Hedrick R P，Gilad O，Yun S，et al．A herpesvirus associated with massmortality of juvenile and adult koi，a strain of common carp［J］．JAquat Anim Health，2000，12(1):44 － 57．

［2］ 劉 葒，史秀杰，高隆英，等．進(jìn)口錦鯉暴發(fā)病病原的nested－PCR 鑒定［J］．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，21(5):414－418．

［3］ Pikarsky E，Ronen A，Abramowitz J，et al．Pathogenesis of acute viral disease induced in fish by carp in－terstitial nephritis and gill necrosis virus［J］．JVirol，2004，78:9544 －9551．

［4］ Aoki T，HironoI，Kurokawa K，et al．Genome sequences of three koi herpesvirus isolates representing the expanding distribution of anemerging disease threatening koi and common carp world wide［J］．JVirol，2007，81:5058 －5065．

［5］ 朱 霞，王 好，周井祥，等．錦鯉皰疹病毒病的研究進(jìn)展［J］．中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2011，41(1):106 －110．

［6］ 李新偉，周井祥，朱 霞，等．錦鯉皰疹病毒－CJ株ORF83基因的克隆及生物信息學(xué)分析［J］．中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2011，41(10):1016－1020．

［7］ 周井祥，李新偉，朱 霞，等．錦鯉皰疹病毒－CJ株ORF25基因的克隆及生物信息學(xué)分析［J］．中國(guó)獸藥雜志，2012，46(3):1－4．

［8］ 周井祥，李新偉，王 好，等．錦鯉皰疹病毒－CJ株ORF81基因的克隆及生物信息學(xué)分析［J］．水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2011，35(12):1780－1786．

［9］ Agus Sunarto，Clifford Liongue，Kenneth A McColl，et al．Koi herpesvirus encodes and expresses a functional interleukin－10［J］．JVirol，2012，86(21):11512 － 11520．

［10］ Takashi Aoki，Tomokazu Takano，Sasimnanas Unajak，et al．Generation of monoclonal antibodies specific for ORF68 of koi herpesvirus［J］．Comparative Immunology，Microbiology and Infectious Diseases，2010，11:1 －8．

［11］ Murwantoko，Dewi Nur’aeni Setyowati，Rarastoeti Pratiwi，et al．Cloning and expression of ORF124 koi herpesvirus as a vaccine［J］．Indonesian Journal of Biotechnology，2012，17(1):42 －50．

［12］朱 霞，王 好，周井祥，等．一株錦鯉皰疹病毒的分離與鑒定［J］．中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，33(5):340 －343．

［13］ Hasegawa S，Somamoto T，Nakayasu C，et al．A cell line(CFK)from fin of isogeneic ginbuna crusian carp［J］．Fish Pathol，1997，32:127－128．

［14］ Neukirch M，Bottcher K，Bunnajirakul S，et al．Isolation of a virus from koiwith altered gills［J］．Bull Eur Assoc Fish Pathol，1999，19:221－224．

［15］ Schult Z U，Kock J，Schlich T H J，et al．Recombinant duck interferon:a new reagent to study the mode of interferon action against H epatitis B virus［J］．Virology，1995，212(2):641 －649．

［16］韋 雪，芳 王，冬 梅，等．信號(hào)肽及其在蛋白質(zhì)表達(dá)中的作用［J］．生物技術(shù)通報(bào)，2006，6:38 －42

［17］ Haagglund P，BunKenborg J，Elortza F，et al．A new strategy for identification of N－glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sitesusing HILIC enrichmentand partial deglycosylation［J］．JProteome Res，2004，3(3):556．

［18］ Weerapana E，Imperiali B．Asparagin e linked protein glycosylation:from eu karyotic to prokaryotic systems［J］．G ycobology，2006，16(6):91R －101R．

［19］ Gunn P，Sato F，Powell K，et al．Rotavirus neutralizing protein VP7:antigenic det－erminants investigated by sequence analysis and peptide synthesis［J］．JVirol，1985，54(3):791 －797．

［20］李海俠，毛旭虎．蛋白質(zhì)抗原表位研究進(jìn)展［J］．微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2007，35(1):54 －58．