山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司 汪孟娟 曹銀生 胡艷霞 王京京 辛國(guó)芹 徐海燕

動(dòng)物呼吸道疾病易造成動(dòng)物生長(zhǎng)減緩、料肉比增高、產(chǎn)蛋力降低、免疫力下降，更有甚者直接導(dǎo)致動(dòng)物死亡或者繼發(fā)其他疾病死亡，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)巨大的損失。然而使用抗生素治療該病又會(huì)帶來(lái)一系列副作用，因此開(kāi)發(fā)一種通過(guò)恢復(fù)和調(diào)整動(dòng)物呼吸道內(nèi)菌群平衡，達(dá)到預(yù)防和治療動(dòng)物呼吸道感染的微生態(tài)制劑十分必要。Sullivan等（2001）認(rèn)為，正常的微生物菌群可以起到防止?jié)撛诘闹虏∥⑸锝ㄈ杭胺乐辜航?jīng)存在的機(jī)會(huì)菌過(guò)度生長(zhǎng)的作用。由此看來(lái)，研究呼吸道正常菌群的演替次序和變化特征，是深入認(rèn)識(shí)炎癥本質(zhì)、開(kāi)發(fā)呼吸道益生菌的理論依據(jù)。

1993年Muzyer等首次將變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術(shù)應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究，并證實(shí)該技術(shù)在研究自然界微生物群落遺傳多樣性和種群差異方面具有明顯的優(yōu)越性。本試驗(yàn)通過(guò)PCR-DGGE技術(shù)分析了肉雞呼吸道細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)，并對(duì)優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行了鑒定，探討此方法在研究動(dòng)物呼吸道微生物多樣性的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集與處理 分別取 10、20、30、40日齡的肉雞（采自泰安某肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)），于超凈臺(tái)下分別取喉管和氣管，剪碎放入無(wú)菌離心管中。

1.1.2 主要儀器 PCR儀、DGGE電泳儀（Bio-Rad）。

1.2 總DNA的提取 向裝有喉管和氣管的離心管中，分別加入5 mL無(wú)菌生理鹽水，振蕩5 min，800 r/min離心10 min，取上清于無(wú)菌1.5 mL EP管中，12000 r/min，離心 2 min，倒掉上清。DNA提取采用Mobile公司的BIO-101 DNA extraction Kit試劑盒，步驟按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 16 S rDNA V3片段的PCR擴(kuò)增 將提取的DNA直接作為PCR模板，采用對(duì)大多數(shù)細(xì)菌的16 S rRNA基因V3區(qū)具有特異性的引物對(duì)（錢麗君，2007）：341F（5’CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCA- CGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和 534R（5’-ATTAC-CGCGGCTGCTGG-3’）， 擴(kuò)增長(zhǎng)約 200 bp， 用于DGGE 分析。 PCR 反應(yīng)體系 （25 μL）：2×Taq mix 12.5 μL，上下游引物（25 pmol/μL）各 1 μL，模板DNA 1 μL，無(wú)菌雙蒸水 9.5 μL。PCR 反應(yīng)條件：采用降落 PCR，94℃預(yù)變性 4 min；94℃ 1 min，65℃45 s，退火溫度每個(gè)循環(huán)降低0.5℃，當(dāng)退火溫度降至55℃后，再以該溫度擴(kuò)增15個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 變性梯度凝膠電泳（DGGE） DGGE變性梯度凝膠濃度為8%，變性梯度為30%～70%（7 mol／L尿素和40%甲酰胺為100%變性）。電泳時(shí)，首先在220 V電壓下預(yù)電泳10 min，隨后在85 V的固定電壓下電泳16 h。電泳結(jié)束后，進(jìn)行硝酸銀染色（Bruck等，2003），用數(shù)碼相機(jī)對(duì)結(jié)果拍照，并采用 Quantity One軟件 （Bio-Rad）對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行聚類分析。

1.5 DGGE圖譜中部分優(yōu)勢(shì)條帶的序列分析用無(wú)菌手術(shù)刀將DGGE圖譜中部分分離明顯、條帶清晰且亮度高的優(yōu)勢(shì)性條帶從凝膠上切下，加入40 μL去離子無(wú)菌水，將膠塊搗碎，4℃過(guò)夜。取液體做模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為去掉“GC夾”的 341 F和 534 R，PCR體系和條件同上（Devillard等，2005）。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rDNA片段的擴(kuò)增 16S rDNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，通用引物341 F及534 R對(duì)各樣品細(xì)菌16 S rRNA基因均得到較好擴(kuò)增。

2.2 DGGE指紋圖譜及圖譜分析結(jié)果 各樣品DGGE指紋圖譜見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，不同部位比較，肉雞的喉和氣管中細(xì)菌的DGGE圖譜的條帶數(shù)、條帶位置和亮度存在一定程度的差異，但總體來(lái)說(shuō)，雖然樣品條帶數(shù)較多，但優(yōu)勢(shì)條帶變化不大，條帶A、B、C、D、E和F在整個(gè)養(yǎng)殖周期的喉和氣管中一直保持優(yōu)勢(shì)地位，經(jīng)鑒定分別為：Citrobacter sp.，Pseudomonas aeruqinosa，Pasteurellaceae bacterium，Uncultured bacterium，Gallibacterium anatis，Uncultured Enterobacteriaceae bacterium。G條帶只在肉雞養(yǎng)殖后期的喉中占優(yōu)勢(shì)，鑒定為：Mycoplasma qallisepticum。

相同部位不同日齡樣品比較，養(yǎng)殖中、后期喉的樣品條帶數(shù)明顯多于養(yǎng)殖前期，其中條帶H和I在養(yǎng)殖中期出現(xiàn)后，便一直存在于整個(gè)養(yǎng)殖過(guò)程，并保持一定的亮度，經(jīng)鑒定為Klebsiella pneumoniae和 Uncultured bacterium，條帶 J雖然在養(yǎng)殖前期的喉管樣品中已被檢測(cè)到，但亮度較暗，在養(yǎng)殖中期的樣品中開(kāi)始變亮，經(jīng)鑒定為Klebsiella pneumoniae；對(duì)于氣管樣品來(lái)說(shuō)，30日齡左右肉雞的氣管樣品條帶數(shù)明顯多于其他時(shí)期。

UPGMA相似性聚類結(jié)果表明，養(yǎng)殖前期樣品喉中的條帶與養(yǎng)殖中后期相似度較低，只有55%；養(yǎng)殖中、后期不同部位，同一時(shí)期的樣品相似度均達(dá)到了75%，說(shuō)明在整個(gè)養(yǎng)殖過(guò)程中，肉雞呼吸道中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)是在發(fā)生變化的。

3 討論

DGGE技術(shù)主要是利用梯度變性膠來(lái)分離DNA片段，理論上認(rèn)為，只要選擇的電泳條件，如變性劑梯度、電泳時(shí)間、電壓等足夠精細(xì)，有一個(gè)堿基差異的DNA片段均可被分開(kāi)。DGGE具有傳統(tǒng)微生物分析方法無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，在科學(xué)研究中廣泛應(yīng)用（Ferguson，2007）。

在本研究中，16S rDNA V3區(qū)的PCR-DGGE圖譜能夠很好地對(duì)肉雞呼吸道中的細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分，雖然數(shù)據(jù)不能代表所有肉雞呼吸道內(nèi)細(xì)菌群落的情況，但可以說(shuō)明PCR-DGGE技術(shù)能夠有效地用于呼吸道菌群的分析。其DGGE圖譜可以反映菌群的組成情況，同時(shí)結(jié)合圖譜中條帶的序列分析，還可以了解具體的優(yōu)勢(shì)菌群的種類。

在畜禽養(yǎng)殖中，應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)可建立一種不依賴傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)而能原位揭示畜禽體內(nèi)細(xì)菌種群組成的分子診斷技術(shù)和病原菌分子診斷技術(shù)。通過(guò)檢測(cè)畜禽呼吸道正常微生物區(qū)系組成，建立基于機(jī)體內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)的健康畜禽動(dòng)物評(píng)價(jià)技術(shù)，還可檢測(cè)畜禽動(dòng)物呼吸道微生物的動(dòng)態(tài)變化和病害后微生物區(qū)系組成的差異，以及使用微生態(tài)制劑前后微生物區(qū)系組成的差異。通過(guò)對(duì)畜禽呼吸道內(nèi)細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)的揭示，為新的畜禽微生物制劑菌株的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供候選菌株和理論基礎(chǔ)。

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