閔婭蘭,程年群,田 虹,劉愛東,劉曉紅,肖 智,曾俊偉

(遵義醫(yī)學院 生理學教研室暨貴州省麻醉與器官功能保護重點實驗室，貴州 遵義 563099)

P2Y受體激動劑2-mesADP誘發(fā)脊髓背角小膠質(zhì)細胞[Ca2+]i升高

閔婭蘭,程年群,田 虹,劉愛東,劉曉紅,肖 智,曾俊偉

(遵義醫(yī)學院 生理學教研室暨貴州省麻醉與器官功能保護重點實驗室，貴州 遵義 563099)

目的觀察體外培養(yǎng)的背角小膠質(zhì)細胞P2Y受體激活對其[Ca2+]i的影響。方法培養(yǎng)并純化脊髓背角小膠質(zhì)細胞，采用激光共聚焦技術(shù)觀察P2Y受體激活后小膠質(zhì)細胞[Ca2+]i 的變化。結(jié)果P2Y 受體激動劑2-mesADP在10 μm即可引起小膠質(zhì)細胞[Ca2+]i升高，當隨著2-mesADP濃度增大，小膠質(zhì)細胞[Ca2+]i升高更為明顯。結(jié)論體外培養(yǎng)的大鼠脊髓背角小膠質(zhì)細胞 P2Y受體激活可以促進細胞[Ca2+]i 升高。

脊髓背角; 小膠質(zhì)細胞; P2Y受體

近年研究表明，脊髓背角小膠質(zhì)細胞在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。鞘內(nèi)注射選擇性的小膠質(zhì)細胞活性抑制劑米諾環(huán)素可以緩解坐骨神經(jīng)炎性痛、關(guān)節(jié)炎性痛、坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷及L5 脊神經(jīng)切斷等模型大鼠的痛覺過敏癥狀[1-3]。但最近通過形態(tài)學方法觀察到P2Y6mRNA,P2Y12mRNA,P2Y13mRNA,P2Y14mRNA受體存在于脊髓背角小膠質(zhì)細胞[4]。鞘內(nèi)注射P2Y6受體拮抗劑MRS2578、P2Y12受體拮抗劑MRS2395、P2Y13受體拮抗劑MRS2211和P2Y14受體反義核酸均可以緩解大鼠神經(jīng)病理性疼痛[4-5]，但其具體機制尚不清楚。因此，本實驗采用離體培養(yǎng)脊髓背角小膠質(zhì)細胞，觀察P2Y 受體激動劑2-mesADP是否可以通過影響小膠質(zhì)細胞[Ca2+]i。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SD 乳鼠由遵義醫(yī)學院實驗動物中心提供。主要試劑: DMEM/F12、DMEM高糖培養(yǎng)基及胎牛血清均為Hyclone 產(chǎn)品；OX-42抗體購自Abcam；抗體稀釋液、山羊免疫組化試劑盒及DAB試劑盒均來自北京中山金橋公司；Fluo-4/ AM及F-127購自Dojindo；2-mesADP購自Sigma。主要儀器：激光掃描共聚焦顯微鏡，德國LeicaTCS2TN 型。

1.2 背角小膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)與鑒定 SD 乳鼠(lt;3 d)，乙醚麻醉,750 mL/L 乙醇消毒，,解剖顯微鏡下取出脊髓背角組織，1.25 mg/mL胰蛋白酶37 ℃消化20～30 min，加入含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，吹打成細胞懸液，,接種于75 mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)10 d 后細胞鋪滿瓶底，置于180 r/min，37 ℃搖床2 h，得到高純度小膠質(zhì)細胞。接種在蓋玻片上培養(yǎng)72 h后，4%多聚甲醛固定15 min，0.01 m PBS漂洗，加入小鼠源OX-42單克隆抗體(1∶500) ，37 ℃1 h ，4 ℃過夜后取出，加入山羊二抗，37 ℃1 h，0.01m PBS中漂洗，5 min×3次；即用型DAB顯色，及時終止反應(yīng)。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察ox-42陽性細胞為小膠質(zhì)細胞。

1.3 激光共聚焦技術(shù)觀察小膠質(zhì)細胞內(nèi)[Ca2+] i濃度變化 將小膠質(zhì)細胞接種于蓋玻片上,隨機分為5組：加入: ①2-mesADP (0.01 μm)；②2-mesADP (0.1 μm)；③2-mesADP(1 μm) ；④2-mesADP(10 μm)；⑤2-mesADP (100 μm)。以未加藥時小膠質(zhì)細胞熒光強度為對照。各組細胞以Fluo-4/ AM (2 μm)熒光指示劑負載，37 ℃避光孵育30 min 后用DMEM高糖培養(yǎng)基漂洗3 遍，以少許DMEM高糖培養(yǎng)基覆蓋細胞，避光待測。掃描技術(shù)參數(shù)為：激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長515 nm，分別加入上述藥物,檢測10 min，得到加藥后鈣熒光圖像并存入計算機中，Ca2 +熒光強度的動態(tài)變化反映胞內(nèi)游離Ca2 +濃度的變化。

1.4 統(tǒng)計學分析 所有計量資料均以表示，采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件分析。兩組間差異顯著性檢驗采用兩獨立樣本的t檢驗，多組均數(shù)間顯著性比較用ANOVA分析，以Plt;0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)的大鼠背角小膠質(zhì)細胞形態(tài)學觀察 倒置相差顯微鏡下見原代培養(yǎng)的背角小膠質(zhì)細胞，胞體較大，可見多個長短不一的纖細突起，呈蜘蛛樣。OX-42陽性細胞為小膠質(zhì)細胞，用免疫化學方法鑒定培養(yǎng)的細胞中OX-42免疫反應(yīng)陽性率gt;90%，表明培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞符合實驗要求。

注：A：混合培養(yǎng)膠質(zhì)細胞 B：純化的小膠質(zhì)細胞OX-42表達。 圖1 小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)形態(tài)觀察

2.2 2-mesADP對背角小膠質(zhì)細胞[Ca2+]i 的影響 與靜息狀態(tài)下小膠質(zhì)細胞熒光強度值相比，0.01 μm 2-mesADP可以誘發(fā)小膠質(zhì)細胞Ca2+熒光強度輕度升高，但不具有統(tǒng)計學意義；0.1～100 μm 2-mesADP可以以劑量依賴的方式誘發(fā)小膠質(zhì)細胞Ca2+熒光強度逐步升高，具有統(tǒng)計學意義(P﹤0.001)； 100 μm 2-mesADP誘發(fā)小膠質(zhì)細胞[Ca2+]i 明顯升高，具有統(tǒng)計學意義(P﹤0.001)。

注：***P﹤0.001，與對照組比較。 圖2 2-mesADP(0.1～100 μm)促進背角小膠質(zhì)細胞Ca2+ 熒光強度升高

3 討論

近來大量研究證明,多種P2Y6受體mRNA,P2Y12受體mRNA,P2Y13mRNA,P2Y14受體mRNA存在于脊髓小膠質(zhì)細胞，但目前對于P2Y受體如何影響小膠質(zhì)細胞生理功能目前并清楚。P2Y6受體與配體結(jié)合后激活Gq蛋白，進而激活磷脂酶C，催化底物磷脂酰肌醇- 4，5-二磷酸(PIP2)水解生成三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油(DAG)，IP3動員細胞內(nèi)Ca2+，產(chǎn)生一系列生物學效應(yīng)[6]。P2Y12受體、P2Y13受體和P2Y14受體可以激活Gi 蛋白，抑制cAMP的產(chǎn)生[7]。但是Lee 和 Chung 也觀察到 ADP激活 P2Y12受體的瞬間細胞內(nèi)cAMP水平上調(diào)并伴有PKA的激活；另外，P2Y12受體激活后也可以通過磷脂酶C途徑引起細胞內(nèi)Ca2+濃度上升，促進PKB磷酸化[8]。在本實驗觀察到，培養(yǎng)的背角小膠質(zhì)細胞，P2Y受體激動劑2-mesADP可以誘發(fā)背角小膠質(zhì)細胞劑量依賴性 [Ca2+]i升高，但這種[Ca2+]i升高是源于何種機制，尚有待進一步探討。在小膠質(zhì)細胞，[Ca2+]i升高有助于促進小膠質(zhì)細胞的增殖活化和一些神經(jīng)活性物質(zhì)的釋放，進而影響小膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元突觸傳遞。這有可能是P2Y受體參與脊髓平面痛覺中樞敏感化的機制之一。

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[5]閔婭蘭,劉曉紅,肖智,等.鞘內(nèi)注射MRS2395對慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎大鼠脊髓背角Iba1表達的影響[J].臨床麻醉學雜志，2012,28(11): 81-84.

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[收稿2012-11-12;修回2012-12-12]

(編輯：譚秀榮)

P2Yreceptoragonistinducedtheincreaseof[Ca2+]iincultureddorsalhornmicroglialcells

Minyalan,Chengnianqun,Tianhong,Liuaidong,Liuxiaohong,Xiaozhi,Zengjunwei

(Department of Physiology,Zunyi Medical University; Guizhuou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo investigate the effect of 2-mesADP (P2Y receptor agonist) on the change of [Ca2+]i in dorsal horn microglial cells.MethodsThe expression of ox-42 in cultured dorsal horn microglial cells was observed by immunohistochemical staining.2-mesADP-induced Ca2+mobilization in cultured dorsal horn microglia was measured by laser scanning confocal microscopy.ResultsCultured dorsal horn microglial cells expressed high level of ox-42.Furthermore,2-mesADP could induce the increase of the Ca2+fluorescent intensity in microglial cells in a dose-dependent manner.ConclusionP2Y receptor agonists 2-mesADP can induce the increase of [Ca2+]i in dorsal horn microglial cells.

Dorsal horn; microglial cell; P2Y receptor

國家自然科學基金資助項目(NO:31000497);遵義醫(yī)學院博士科研啟動基金項目(NO：2009)。

曾俊偉,女，副教授，研究方向：疼痛生物學機制，E-mail:junweizeng@sohu.com。

R744.5

A

1000-2715(2013)01-0010-03