★ 陳樂 謝玲 熊學(xué)敏

(1.江西省中醫(yī)藥研究院 南昌 330077；2.江西中醫(yī)學(xué)院 南昌 330004)

車前子超微速溶飲片中京尼平苷酸與毛蕊花糖苷的含量測(cè)定

★ 陳樂1謝玲2熊學(xué)敏1

(1.江西省中醫(yī)藥研究院 南昌 330077；2.江西中醫(yī)學(xué)院 南昌 330004)

目的:建立一種同步測(cè)定車前子超微速溶飲片中京尼平苷酸與毛蕊花糖苷含量的高效液相色譜方法。方法:色譜柱為Hypersil ODS2 C18柱(4.6 mm×250 mm, 5μm), 流速:1.0mL/min, 檢測(cè)波長：254 nm, 柱溫：35℃。結(jié)果:京尼平苷酸與毛蕊花糖苷的線性范圍分別為59.88μg/mL～159.68μg/mL(r=0.9999)和91.26μg/mL～243.36μg/mL(r=0.9999)；平均加樣回收率分別為100.5%(RSD=1.1%，n=6)和99.7% (RSD=1.3%，n=6)。結(jié)論:本方法操作簡(jiǎn)便，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可作為該產(chǎn)品質(zhì)控的方法。

京尼平苷酸；毛蕊花糖苷；HPLC

車前子為車前科(Plantaginaceae)植物車前(PlantagoasciaticaL.) 或平車前(PlantagodepressaWilld.) 的干燥成熟種子[1], 具有清熱利尿、滲濕通淋、明目祛痰的功效。目前關(guān)于車前子中含量測(cè)定的報(bào)道多集中于多糖，車前子苷及桃葉珊瑚苷[2-3],而京尼平苷酸與毛蕊花糖苷的含量的文獻(xiàn)報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)在對(duì)車前子粉末研究的基礎(chǔ)上，采用HPLC法，建立同步測(cè)定車前子超微速溶飲片中的京尼平苷酸與毛蕊花糖苷含量的研究，通過試驗(yàn)證明，由于藥材的超微分化作用，其含量比對(duì)應(yīng)的車前子藥材含量要高。

本研究在制備單味中藥超微速溶飲片工藝中，首次將超微粉碎技術(shù)、微波滅菌技術(shù) 、真空包裝、干法制粒等新技術(shù)同步運(yùn)用到中藥飲片的研究及加工領(lǐng)域，將中藥飲片加工成微米級(jí)的顆粒飲片，使中藥飲片從內(nèi)在質(zhì)量到外觀包裝都有了新的提高. 單味中藥超微速溶飲片，既保留了傳統(tǒng)飲片的特色與優(yōu)勢(shì)，又避免了煎煮的麻煩，且節(jié)省藥材、方便服用，是中藥飲片領(lǐng)域的一項(xiàng)創(chuàng)新性工作，這一研制成果對(duì)保護(hù)藥材資源，促進(jìn)中藥現(xiàn)代化、產(chǎn)業(yè)化具有十分重要的意義。

1 儀器與試藥

島津LC-20AD高效液相色譜儀(LC-solution工作站，LC-20AD二元泵，SPD-20A紫外檢測(cè)器，10μL定量環(huán))，SimplicityTM型超純水系統(tǒng)(Millipore公司)；Mettller Tkledo AG135雙量程電子天平( 十萬分之一)；京尼平苷酸對(duì)照品( 供含量測(cè)定用，批號(hào)：111828 - 201102，中國藥品生物制品檢定所供)；毛蕊花糖苷對(duì)照品(供含量測(cè)定用，批號(hào):111530-200706，中國藥品生物制品檢定所供)；車前子超微速溶飲片(自制，批號(hào)：20120401、20120402、20120403)，試驗(yàn)用乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS2 C18(250 mm×4.6 mm,5μm，大連依利特公司)；檢測(cè)波長為254nm；流速為1.0mL/min；柱溫為35℃；進(jìn)樣體積為10μL；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%磷酸水溶液(A+B=100%)，流動(dòng)相超聲脫氣，梯度洗脫。見表1。

表1 流動(dòng)相

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

取京尼平苷酸對(duì)照品和毛蕊花糖苷對(duì)照品適量,精密稱定，加60%甲醇溶解并定量稀釋制成濃度為京尼平苷酸99.8μg/mL和毛蕊花糖苷182.52μg/mL的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

取車前子超微速溶飲片約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇50mL,稱定重量，加熱回流2h，放置室溫，再稱定重量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別精密吸取混和對(duì)照品液(按“2.2.1”項(xiàng)下制備)、供試品溶液(按“2.2.2”項(xiàng)下制備)及乙腈各10μL,注入高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，記錄色譜圖(結(jié)果見圖1-3)。結(jié)果表明，在此色譜條件下，京尼平苷酸、毛蕊花糖苷的保留時(shí)間分別約為5min和25min,分離度良好。理論板數(shù)按京尼平苷酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000，按毛蕊花糖苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。

圖1 混合對(duì)照品色譜圖

圖2 樣品色譜圖

圖3 陰性色譜圖

2.4 線性關(guān)系

分別精密稱取京尼平苷酸對(duì)照品9.98mg與毛蕊花糖苷對(duì)照品15.21mg,分別置50mL棕色量瓶中,加60%甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得.分別精密吸取上述2種對(duì)照品溶液3,4 ,5,6,7,8mL,分別置10mL容量瓶中,加60%甲醇稀釋至刻度, 搖勻,作為系列對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述6份對(duì)照品溶液各10μL ,按選定色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以進(jìn)樣濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo), 峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,京尼平苷酸的回歸方程為Y=1.80×104X+8.23×103,r=0.9999；毛蕊花糖苷的回歸方程為Y=1.78×104X+1.18×104,r=0.9999；結(jié)果表明京尼平苷酸在59.88μg/mL～159.68μg/mL之間線性范圍良好，毛蕊花糖苷在91.26μg/mL～243.36μg/mL之間線性范圍良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的方法連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定京尼平苷酸，毛蕊花糖苷的峰面積，結(jié)果：RSD分別為 1.6%、1.9%(n=6)，表明精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批車前子超微速溶飲片(批號(hào):20120401)按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，精密量取10μL，注入液相色譜儀，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。結(jié)果京尼平苷酸，毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為1.7% , 1.4%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取車前子超微粉末(批號(hào)：20120401)，按“2.2.2”項(xiàng)下平行制備6份供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12h進(jìn)樣測(cè)定，記錄京尼平苷酸與毛蕊花糖苷的峰面積，RSD分別為1.3%，1.7%(n=6)， 結(jié)果表明，12h內(nèi)供試品溶液中京尼平苷酸、毛蕊花糖苷基本穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的車前子超微速溶飲片(20120401)，分別定量加入京尼平苷酸對(duì)照品與毛蕊花糖苷對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試溶液。精密進(jìn)樣10μL。按“2.1”色譜條件測(cè)定，計(jì)算京尼平苷酸平均回收率為100.5%，RSD值為1.1%；毛蕊花糖苷平均回收率為99.7%，RSD值為1.3%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.9 樣品含量測(cè)定

取3批車前子超微速溶飲片約1g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依次進(jìn)樣記錄峰面積。對(duì)照品溶液按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備,用外標(biāo)法計(jì)算2種成分的含量，結(jié)果3批樣品含量見表4。

表4 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)如采用2010版藥典一部對(duì)應(yīng)車前子藥材項(xiàng)下含量測(cè)定的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，峰形不好，保留時(shí)間長，基線漂移現(xiàn)象嚴(yán)重；后分別改用乙腈∶甲醇∶1%醋酸(10∶15∶75)；乙腈∶甲醇∶0.1%醋酸(10∶15∶75)；乙腈∶甲醇∶0.5%磷酸(10∶15∶75)；流動(dòng)相A 為乙腈,流動(dòng)相B為0.1%磷酸梯度洗脫等4種系統(tǒng)作為流動(dòng)相，前3種系統(tǒng)分離效果均不好，京尼平苷酸出峰時(shí)間短，峰形不好；第4種系統(tǒng)京尼平苷酸和毛蕊花糖苷與相鄰峰得到較好的分離，峰形也較好。

[1] 國家藥典委員會(huì).中國藥典[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000:51.

[2] 高明哲,袁呂魯,徐青,等.高效液相色譜法測(cè)定大車前子中車前子苷的含量[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2004,18(增刊):34-36.

[3] 吳祥松,劉賢旺,黃慧蓮,等.江西道地藥材車前子中桃葉珊瑚苷含量的測(cè)定[J].中藥科技,2002,4(11):18-20.

[4] 國家藥典委員會(huì).中國藥典[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:63.

TheDeterminationofGeniposidicAcidandVerbascosideinPlantainSeedUltraInstantPieces

CHENLe1,XIELing2,XIONGXue-min1

1.JiangxiChineseTraditionalMedicineinstituteofResearch,Nanchang, 330077,China;2.JiangxiChineseTraditionalMedicineUniversity,Nanchang, 330004,China.

Objective: To establish a method for the determination of geniposidic acid and verbascoside in superfine instant pieces of Semen Plantaginis by HPLC. Methods:The HPLC analysis was performed on a Hypersil ODS2 C18column (4.6mm×250mm, 5μm),The flow rate was 1.0mL/min,the detection wave-length was 254nm,the column temperature was 30℃.Results: The linear ranges of geniposidic acid and verbascoside were59.88～159.68μg·mL-1(r=0.9999)and91.26μg/mL～243.36μg/mL (r=0.9999);The average recoveries were 100.5% (RSD=1.1%,n=6) and 99.7% (RSD=1.3%,n=6).Conclusion:The method is convenient,rapid and accurate.It can be used in the quality control of superfine instant pieces of Semen Plantaginis .

Geniposidic Acid ; Verbascoside ; HPLC

R 284.1

A

2013-02-28)