龍再浩 孫 運 馬中春 李 冰

(寧波檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院 浙江寧波 315012)

1 前言

目前我國6個月內(nèi)嬰幼兒純母乳喂養(yǎng)率約為30%，單純配方奶粉或混合喂養(yǎng)是我國嬰幼兒主要喂養(yǎng)方式，因此嬰幼兒配方奶粉的質(zhì)量與嬰幼兒的生長發(fā)育密切相關(guān)。牛乳是嬰幼兒配方奶粉最主要的原材料，但牛乳中蛋白成分會導(dǎo)致嬰幼兒出現(xiàn)過敏反應(yīng)，表現(xiàn)出皮膚和胃腸道癥狀，嚴(yán)重會出現(xiàn)過敏性休克。據(jù)國外流行病學(xué)研究嬰幼兒發(fā)生牛乳過敏率約為2%-4%，是牛乳過敏的高危人群。牛乳中約有20多種蛋白成分，其中β-乳球蛋白（βLG）是牛乳中一種主要蛋白，它在人乳中并不存在，是牛乳蛋白中最主要的致敏性蛋白之一[1-3]。嬰幼兒配方奶粉中牛乳蛋白會經(jīng)過處理，致敏性明顯降低，一般不含有牛乳βLG。

目前用于牛乳βLG檢測的方法有多種，包括高效液相法[4]、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[5]、毛細(xì)管電泳法[5,6]、聚丙烯酰胺凝膠電泳法[7]等。熒光偏振免疫技術(shù)（FPIA）基于抗原-抗體相互作用和熒光檢測，已用于食品、水、農(nóng)產(chǎn)品中生物毒素、殺蟲劑、環(huán)境污染物檢測，人體藥物濃度監(jiān)測和激素檢測、布氏桿菌等檢測，它與ELISA法相比，具有操作更簡便、檢測速度更快的特點，適合于高通量樣品的快速篩查[8]。本研究采用FPIA技術(shù)建立測定βLG的檢測方法，并應(yīng)用于嬰幼兒配方奶粉的檢測。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試劑

弗氏完全佐劑與不完全佐劑、異硫氰酸熒光素（FITC）蛋白標(biāo)記試劑盒、βLG標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；PBS緩沖液：pH7.4；新西蘭家兔：浙江省實驗動物中心。

2.1.2 儀器

SpectraMax M5酶標(biāo)儀：美國MD公司；黑色96孔反應(yīng)板：美國Corning公司。

2.2 方法

2.2.1 多克隆抗體制備

共免疫3只動物，過程如下：采用家兔背部皮膚多點注射，共免疫4次。首次免疫注射蛋白+弗氏完全佐劑，第21天、35天、45天注射蛋白+弗氏不完全佐劑進(jìn)行免疫，第51天心臟取血，4℃隔夜靜置，離心取血清，用飽和硫酸銨法純化[9,10]，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 示蹤物的合成和活性鑒定

示蹤物的合成和純化過程：用重碳酸鹽緩沖液分別配置待標(biāo)記的蛋白溶液（5mg/mL）和FITC溶液，取0.2mL蛋白溶液加入到反應(yīng)管中，逐滴加入FITC溶液共計50μL，并緩慢震蕩攪拌，室溫孵育2h，用Sephadax G-25M柱分離標(biāo)記蛋白，收集溶液備用。

示蹤物活性鑒定：測定示蹤物單獨熒光偏振值FP，倍比稀釋特異性抗體和倍比稀釋非特異性抗體（1/25、1/50…1/12800）結(jié)合后的熒光偏振值FP。

2.2.3 FPIA測定

2.2.3.1 示蹤物工作濃度

將微孔板中示蹤物熒光強度約為60U濃度設(shè)定為工作濃度。

2.2.3.2 抗體工作濃度

將多抗用PBS溶液進(jìn)行倍比稀釋，稀釋濃度分別為1/25、1/50、1/100、1/200…、1/25600。取100μL抗體稀釋液和50μL熒光標(biāo)記物加入96孔板，反應(yīng)2 min后測量FP值，取70%結(jié)合時抗體稀釋度為抗體的工作濃度。

2.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液

用PBS緩沖液配制10個不同質(zhì)量濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)溶液105ng/mL、104ng/mL、5×103ng/mL、2000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL和10ng/mL。

2.2.3.4 FPIA程序

將100μL抗體、50μL示蹤物與50μL不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液同時加入96孔微孔板，反應(yīng)5min后測量FP值。

2.2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合

應(yīng)用originPro7.0軟件中四參數(shù)方程模塊擬合競爭標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算半數(shù)抑制濃度（IC50）、檢測限（IC10）和檢測范圍（IC20-IC80）。

2.2.4 樣品檢測

2.2.4.1 樣品制備

樣品制備過程參考文獻(xiàn)[5]，簡述如下：取1g樣品加入10 mL蒸餾水，混勻15 min；用Whatman 40濾紙過濾，然后加入1mol/L稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值為4.6，室溫靜置20min；4℃條件下4500g離心20min，收集上清液，PVDF膜（孔徑0.45μm）過濾，Tuffryn膜（孔徑0.22μm）過濾，最后收集濾液待檢。

2.2.4.2 定量測定

對建立方法的動力學(xué)、特異性以及回收率進(jìn)行研究，并應(yīng)用對市售兩類嬰幼兒產(chǎn)品（米粉和配方奶粉）共9個樣品進(jìn)行檢測，測定樣品中βLG水平。

3 結(jié)果與討論

3.1 示蹤物的合成與活性鑒定

FITC異構(gòu)體I因為具有較高熒光量子效率以及結(jié)合物非常穩(wěn)定，是目前最廣泛使用的熒光標(biāo)記試劑，F(xiàn)ITC與蛋白的自由氨基反應(yīng)形成穩(wěn)定的結(jié)合物（見圖1）。

圖1 示蹤物的合成

示蹤物與特異性抗體反應(yīng)活性是FPIA方法建立的基礎(chǔ)。用示蹤物與抗體、倍比稀釋抗體和倍比稀釋對照抗體反應(yīng)測定熒光偏振值來鑒定合成示蹤物的活性，結(jié)果見圖2。測定100μL 熒光標(biāo)記物的熒光偏振值約為118mp，當(dāng)加入100μL抗體反應(yīng)2min后測定熒光偏振值約300mp，表明熒光偏振強度發(fā)生顯著變化。

圖2 熒光標(biāo)記物的活性鑒定

從圖2可見，當(dāng)用倍比稀釋抗體與示蹤物反應(yīng)后，熒光偏振值隨抗體稀釋度的增加而不斷降低，當(dāng)稀釋度到達(dá)1/12800，熒光偏振值保持在120mp單位左右；相反，加入陰性對照抗體，熒光偏振值不會隨著抗體稀釋度增加，因此未發(fā)生明顯變化，偏振光值保持在120mp波動。試驗結(jié)果表明，合成的示蹤物具有良好的活性，能夠與特異性抗體結(jié)合。

3.2 示蹤物和抗體工作濃度

FPIA方法的靈敏度與示蹤物及抗體的工作濃度相關(guān)。一般示蹤物的濃度越低，則建立的方法靈敏度越高。但如果示蹤物濃度過低，則會影響熒光信號的測量[11]。在研究過程中稀釋示蹤物，熒光強度約60U時示蹤物濃度設(shè)定為工作濃度取得了較好的靈敏度。

抗體活性/工作濃度是FPIA方法建立的關(guān)鍵。在制備多克隆抗體時，共免疫了3只家兔，獲得了3個不同動物個體來源的抗體，3組抗體與示蹤物結(jié)合后的稀釋度曲線見圖3。

圖3 熒光標(biāo)記物與βLG蛋白多克隆抗體稀釋曲線

從圖3可見，3只動物獲得的抗體稀釋度曲線相差不大，并且2號與3號抗體的曲線較為相似。在3條稀釋度曲線中，1號抗體在抗體稀釋度最小時（1/25）獲得FP值最高，2號和3號抗體的最大FP值相近，當(dāng)抗體濃度稀釋至1/12800時，3個抗體與示蹤物結(jié)合后FP值相差不大。根據(jù)樣品稀釋度曲線圖，選擇2號抗體作為本方法中使用的抗體，其工作濃度設(shè)定為與示蹤物70%結(jié)合的抗體稀釋度即1/200稀釋度作為抗體的工作濃度。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將100μL示蹤物、50μL抗體與10個濃度的50μL標(biāo)準(zhǔn)溶液加入反應(yīng)孔中，反應(yīng)后測定的熒光偏振值用軟件按照四參數(shù)方程擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖4）。

圖4 βLG的競爭性熒光偏振免疫檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4顯示，曲線呈S形，R2為0.997，表明曲線擬合良好，符合競爭性反應(yīng)曲線特征。方法檢出限（IC10）為0.75 mg/L；半數(shù)抑制劑量（IC50）為0.75mg/L；檢測線性范圍（IC20-IC80）為0.22mg/L-2.53mg/L。

3.4 動力學(xué)研究

為選擇合適的熒光偏振測定時間，需要研究抗體、示蹤物與標(biāo)準(zhǔn)品/樣品三者之間競爭性反應(yīng)體系的動力學(xué)特征。將4個濃度（10 ng/mL、100 ng/mL、1000 ng/mL和5000 ng/mL）標(biāo)準(zhǔn)溶液與示蹤物及抗體混合，反應(yīng)2min后開始測定FP值，每min測量一次，連續(xù)測10次，測量結(jié)果見圖5。

圖5 βLG的競爭性熒光偏振免疫檢測動力學(xué)曲線

從圖5可見，4條動力學(xué)曲線波動較小，基本上保持穩(wěn)定，這表明樣品/標(biāo)準(zhǔn)品、示蹤物和抗體三者之間競爭性反應(yīng)能夠快速達(dá)到平衡，加入樣品后基本上不需等待就可以開始測量。

3.5 方法特異性

方法的特異性主要體現(xiàn)為抗體的交叉反應(yīng)率，交叉反應(yīng)率越高，方法特異性越低。應(yīng)用已建立FPIA程序測定4種主要牛乳蛋白（a-乳白蛋白、酪蛋白、α-酪蛋白和β-酪蛋白）的IC50，計算交叉反應(yīng)率（CR%），結(jié)果見表1。

4種牛乳蛋白的交叉反應(yīng)率都低于0.1%，表明在檢測范圍內(nèi)，本方法特異性較高。

表1 抗體與主要致敏性牛乳蛋白的交叉反應(yīng)

3.6 添加回收率

用嬰兒米粉作空白，添加3種不同質(zhì)量濃度βLG，按照前樣品處理方法和FPIA程序檢測，每個濃度設(shè)3個平行，每次測定3次，計算平均回收率，結(jié)果見表2。

表2 方法回收率

從表2中可見測量結(jié)果CV范圍為9.4%-13.9%，回收率范圍為87%-93.2%。

3.7 樣品檢測

應(yīng)用本方法對9種嬰幼兒食品中牛乳βLG水平進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，在3種嬰幼兒米粉中均未檢測出βLG，在6種嬰幼兒配方奶粉有3個產(chǎn)品檢測出βLG，含量在23.5mg/g-32.6mg/g。

4 結(jié)論

本文制備了牛乳βLG的多克隆抗體，使用FITC合成有活性的示蹤物，建立基于FPIA技術(shù)的牛乳βLG的檢測方法。本方法操作簡便、快速，適用于嬰幼兒配方奶粉等致敏原牛乳βLG快速檢測。

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