劉 輝 譚素嫻 何藝梅

(茂名出入境檢驗(yàn)檢疫局 廣東茂名 525000)

1 前言

孔雀石綠和結(jié)晶紫屬于三苯甲烷類人工合成有機(jī)染料，它們及其代謝產(chǎn)物具有致癌性，我國(guó)于2002年將其列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物。由于染料藥物與組織蛋白結(jié)合非常強(qiáng)，而且魚和脂肪組織中所含的脂肪會(huì)產(chǎn)生乳化作用，因此對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)的關(guān)鍵在于前處理，單一溶劑萃取的效果不甚理想[1]?，F(xiàn)在比較好的提取方法是離子對(duì)提取法，國(guó)標(biāo)GB/T19857-2005《水產(chǎn)中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定》[2]也是采用該方法。但在實(shí)踐過程中，GB/T19857-2005存在如下不足：有機(jī)溶劑用量大，操作步驟繁雜，檢測(cè)成本高等。因此，本研究結(jié)合工作需要，在國(guó)標(biāo)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化，創(chuàng)造出一種類似QuEChERS的方法[3]。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試驗(yàn)樣品

試驗(yàn)樣品為送檢的凍羅非魚和凍蝦。

2.1.2 儀器

Quattro Premier XE UPLC-MS/MS：Waters公司；渦旋振蕩器：IKA公司；P-12平行蒸發(fā)儀：Buchi公司；超聲儀：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；3-18K 高速離心機(jī)：Sigma公司。

2.1.3 試劑

乙腈、二氯甲烷、乙酸銨：Fisher，均為色譜純；甲酸：TEDI，色譜純；無水硫酸鈉：優(yōu)級(jí)純；C18散裝填料：BESEP；孔雀石綠（MG）、隱性孔雀石綠（LMG）、結(jié)晶紫（CV）、隱性結(jié)晶紫（LCV）標(biāo)準(zhǔn)品：德國(guó)Dr公司。

2.2 方法

2.2.1 儀器工作條件

2.2.1.1 色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18 1.7μm（2.1×50 mm）；柱溫：40℃；進(jìn)樣體積：10μL；流動(dòng)相：A（5mmol/L乙酸銨+0.1% FA）-B（乙腈），梯度見表1。

表1 液相色譜梯度表

2.2.1.2 質(zhì)譜條件

毛細(xì)管電壓：3.5KV；源溫：120℃；脫溶劑溫度：450℃；脫溶劑氣流速：600 L/h；采集方式：ES(+),MRM方式；離子對(duì)信息：詳見GB/T19857-2005。

2.2.2 測(cè)定方法

2.2.2.1 樣品制備

稱取3.00g樣品于50mL聚四氟乙烯離心管中，加入30ng/mL的內(nèi)標(biāo)混合液100μL，然后加入10.00mL乙腈，高速渦旋混合使其充分分散；再加入5mL 0.1mol/L的乙酸銨緩沖液（pH=4.5），0.5g C18散裝填料，3g無水硫酸鈉，渦旋混勻；超聲10min，12000r/min離心5min，上清液全部倒入另一離心管中；加入5.00mL二氯甲烷，渦旋混勻，離心5min；吸取10.00mL上清液于平行蒸發(fā)儀的試管中，45℃下蒸干；準(zhǔn)確加入1.00mL乙腈-5mmol/L乙酸銨（含0.1%FA）（1:1）洗脫、定容，過0.20μm濾膜后上機(jī)測(cè)定。

2.2.2.2 校準(zhǔn)曲線的配制

稱取空白樣品6份，按2.2.2.1處理（不加內(nèi)標(biāo)），最終每個(gè)樣品定容到2mL；混合6個(gè)空白樣品的定容液作為基質(zhì)液，然后用基質(zhì)液作為稀釋液，配制如下濃度的校準(zhǔn)曲線：0、0.5、1、2、5、10ng/mL，內(nèi)標(biāo)加入量按2ng/mL加入。上機(jī)測(cè)定，各項(xiàng)目回歸方程線性關(guān)系良好，r＞0.999。

3 結(jié)果

3.1 方法檢測(cè)限

經(jīng)過優(yōu)化的方法所有指標(biāo)的檢測(cè)限均≤0.5μg/kg，與現(xiàn)行國(guó)標(biāo)方法相當(dāng)。0.5μg/kg濃度空白樣品加標(biāo)總離子流圖見圖1，從圖中可見所有指標(biāo)均有比較好的峰形與信噪比（S/N≥50）。

圖1 0.5μg/kg加標(biāo)樣品總離子流圖

3.2 基質(zhì)抑制率比較

質(zhì)譜方法容易受到基質(zhì)的干擾，一個(gè)好的方法必須要將基質(zhì)抑制率降到最低。基質(zhì)抑制率的計(jì)算方法是：在同一濃度水平下，用流動(dòng)相配制的標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)峰面積減去用基質(zhì)液配制的標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)峰面積，然后除以用流動(dòng)相配制的標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)峰面積。方法的基質(zhì)抑制率越低其凈化效果就越好。本研究用相應(yīng)的基質(zhì)液配制濃度為1.0ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)平行測(cè)定6次計(jì)算平均值。比較GB/T19857-2005和本研究方法的基質(zhì)抑制率，結(jié)果見表 2。

表2 基質(zhì)抑制率比較表（n=6）

（續(xù)表）

表2顯示本方法的基質(zhì)抑制率與國(guó)標(biāo)方法基本相當(dāng)，凈化效果基本一致。另外表2還顯示：一方面不同的產(chǎn)品有不同的基質(zhì)抑制率，蝦的基質(zhì)抑制率比較魚略大；另一方面不同項(xiàng)目的基質(zhì)抑制率也不同，對(duì)LMG、LCV的抑制要明顯大于MG、CV。

3.3 方法的回收率與精密度

取日常檢測(cè)的凍羅非魚和凍蝦作為樣品，進(jìn)行空白加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)濃度為：0.5、1.0、5.0μg/kg三個(gè)水平，每個(gè)濃度分別制備6份，上機(jī)測(cè)定計(jì)算回收率和RSD，結(jié)果見表 3。

表3 不同介質(zhì)及不同濃度下的加標(biāo)回收率（n=6）

3.4 實(shí)際樣品測(cè)定

在過去的一年中，運(yùn)用該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)送檢的1500多個(gè)樣品進(jìn)行了檢測(cè)，檢到陽(yáng)性樣品4個(gè)。陽(yáng)性樣品均送上級(jí)檢驗(yàn)部門復(fù)核，復(fù)核結(jié)果和檢測(cè)結(jié)果完全符合，說明該方法具有較好的穩(wěn)健性和準(zhǔn)確性。其中一個(gè)陽(yáng)性樣品（LMG:0.64μg/kg）冰箱留樣復(fù)檢圖見圖2。

圖2 LMG陽(yáng)性（0.64μg/kg）復(fù)檢離子流圖

4 討論

4.1 提取緩沖液的選擇

在優(yōu)化過程中，考察了不同的緩沖體系（甲酸銨、乙酸銨、磷酸鹽），不同的緩沖液濃度（0.05、0.1、0.2、0.5mol/L）和不同的pH值（3、3.5、4、4.5、5、9）對(duì)提取效率的影響。結(jié)果顯示：乙酸銨緩沖體系提取結(jié)果相對(duì)干凈；同一緩沖體系在同一pH值下，不同濃度的緩沖液對(duì)提取結(jié)果影響不大；pH是影響最大的因素，pH為4.5-5時(shí)最合適，其他范圍MG均受到不同程度的破壞，特別是在pH=9的時(shí)候，MG基本破壞盡，上機(jī)幾乎檢測(cè)不到峰值。所以在參考國(guó)標(biāo)的基礎(chǔ)上選定0.1mol/L的乙酸銨（pH=4.5）作為提取緩沖液。

4.2 方法凈化原理分析

水產(chǎn)樣品分析過程中，主要干擾物是油脂和蛋白。本研究主要利用有機(jī)溶劑沉淀蛋白，C18散裝填料近年來在國(guó)際多獸藥殘留檢測(cè)中有比較廣泛的應(yīng)用，主要用于吸附油脂[4-5]。乙酸銨緩沖液作為離子對(duì)試劑，硫酸鈉作為鹽析試劑，二氯甲烷作為極性改進(jìn)劑，改變乙腈的極性使其能與水層完全分離，而且乙腈與二氯甲烷的比例必須大于或等于2：1，否則乙腈層與水層無法完全分離，提取液中存在一定的水相，無法完全蒸干而且存在暴沸的風(fēng)險(xiǎn)。

4.3 試劑添加順序的探討

本研究在實(shí)施過程中，最佳的試劑添加順序?yàn)椋阂译妗?.1mol/L乙酸銨、C18，上清液轉(zhuǎn)另一管后再加二氯甲烷。但對(duì)于像蝦這種非常粘稠的樣品，先用乙腈可能無法將其渦旋分散，因此可以先加0.1mol/L乙酸銨將其渦旋分散，再加乙腈，而C18必須在二者添加后才能加，否則會(huì)引起回收率偏低。其原因可能是一方面C18是一種非極性通用型吸附劑，對(duì)非極性物質(zhì)具有比較好的吸附效果，MG類物質(zhì)極性不大也可能被其吸附，另一方面MG類物質(zhì)的PKa在6.5左右，在pH=4.5的乙酸銨緩沖液下，其已經(jīng)充分離子化，從而不易被C18吸附，所以加入的順序必須注意。另外，二氯甲烷的加入必須將上清倒入另一管后再加，如果在同一管內(nèi)加入，魚肉中的很多非極性物質(zhì)會(huì)被萃取進(jìn)來而帶來很大干擾，還可能造成分層困難（易乳化）。

5 結(jié)論

本研究建立的方法與國(guó)標(biāo)法相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)：處理步驟簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快；有機(jī)溶劑用量少，總共只用了15mL有機(jī)溶劑；檢測(cè)成本低，可只用C18散裝填料，不必使用價(jià)格昂貴的固相萃取小柱，成本大概為2元/樣品；檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，經(jīng)過本實(shí)驗(yàn)室一年多來的實(shí)踐應(yīng)用，獲得了比較理想的效果，值得推廣和應(yīng)用。

［1］龐國(guó)芳，等.農(nóng)藥獸藥殘留現(xiàn)代分析技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，2007:488-489.

［2］GB/T 19857-2005 水產(chǎn)中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定[S].

［3］陳小華，汪群杰.固相萃取技術(shù)與應(yīng)用[M].北京：科學(xué)出版社，2010:162.

［4］Waters Application Note.Optimized Extraction and Clear up Protocols for LC-MS/MS Multi-Residue Determination of Veterinary drugs in Edible Muscle Tissues.2011.

［5］S Lehotay.High-Throughput Screening Analysis by UPLC-MS/MS of 60 Veterinary Drugs in Animal Tissues[R].125thAOAC Annual Meeting Presentation 2303,21 September ,2011.