李輝 馬曉光 石潔 閆國蕊 楊洪毅 趙玉玲

結(jié)核病是危害嚴(yán)重的一種傳染性疾病，據(jù)WHO估計全球約30%的人群感染Mtb，每年新發(fā)結(jié)核病患者880萬［1］。中國作為22個結(jié)核病高負擔(dān)國家之一，總患者數(shù)僅次于印度，位居第二。河南省為我國人口第一大省，也是結(jié)核病高負擔(dān)地區(qū)，據(jù)2000年結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查估算，全省有活動性肺結(jié)核患者約46萬，其中Mtb陽性肺結(jié)核患者約15萬［2］。隨著國家結(jié)核病防治規(guī)劃和DOTS策略的實施，為揭示河南省結(jié)核病現(xiàn)狀及變化規(guī)律，2010年河南省進行了全省結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查（簡稱“流調(diào)”）?，F(xiàn)將調(diào)查點的細菌學(xué)檢測結(jié)果分析如下，以期揭示河南省人群中耐藥結(jié)核病及結(jié)核分枝桿菌的基本特性。

材料和方法

一、資料來源

1．調(diào)查范圍：依據(jù)文獻［3］的抽樣規(guī)則，由全國第五次結(jié)核病流調(diào)技術(shù)指導(dǎo)組計算并確定抽取河南省36個點，共涉及18個地市的36個縣。對流調(diào)點所有的受檢對象（包括已知肺結(jié)核患者）均進行X線胸片檢查；對發(fā)現(xiàn)的所有肺結(jié)核可疑癥狀者和（或）胸部X線影像呈肺結(jié)核病變或疑似結(jié)核病變者，或已知活動性肺結(jié)核患者但X線影像未見異常者均作為痰涂片和分離培養(yǎng)檢查的對象。按照衛(wèi)生部的統(tǒng)一部署和河南省衛(wèi)生廳的組織安排，河南省以地市為單位成立了18個流調(diào)隊，于2010年4—7月以流調(diào)隊現(xiàn)場實施，省技術(shù)組督導(dǎo)、驗收的方式進行了第五次全國結(jié)核病流調(diào)的河南省現(xiàn)場調(diào)查工作。

2．調(diào)查對象基本情況：河南省抽樣人口99 977名，應(yīng)檢51 135名，實檢49 091名，總受檢率占抽樣人口的49．10%，占應(yīng)檢人口的96．00%；36個流調(diào)點所有受檢對象（包括已知肺結(jié)核患者）均攝X線胸片檢查，共發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核可疑癥狀者和（或）X線胸片異常者2877例。其中活動性肺結(jié)核患者261例；年齡15～91歲，平均（51．2±15．95）歲；男189例，女72例。對所有發(fā)現(xiàn)的肺結(jié)核可疑癥狀者和（或）X線胸片異常者2877例進行了痰涂片檢查，痰涂片陽性35例，痰涂片陽性率1．22%；除2例因痰標(biāo)本損壞無法痰培養(yǎng)外，2875例均進行了痰分離培養(yǎng)，培養(yǎng)54例陽性。

二、方法

1．痰標(biāo)本收集和保存：按照文獻［3］要求收集和保存痰標(biāo)本，每位檢查對象分別收集即時痰、晨痰和夜間痰各1份，痰標(biāo)本必須在24h內(nèi)完成涂片，進行分離培養(yǎng)的痰標(biāo)本，如當(dāng)天不能進行分離培養(yǎng)，需4℃冷藏保存，在6d內(nèi)完成培養(yǎng)工作。

2．涂片檢查：對收集的每份痰標(biāo)本按文獻［4］規(guī)定的操作程序進行萋-尼染色、顯微鏡檢查和結(jié)果判讀。痰涂片檢查在各流調(diào)點進行。

3．痰培養(yǎng)：2877例涂片鏡檢對象中除2例標(biāo)本損失外，2875例的痰標(biāo)本進行了培養(yǎng)，每例患者從涂片鏡檢后的3份痰標(biāo)本中選擇2份涂片高陽性級別或1份涂片陽性和1份涂片陰性但質(zhì)量好的標(biāo)本，或2份質(zhì)量好的涂片陰性標(biāo)本按照文獻［5］的方法進行堿處理簡單法消化，消化液分別接種于2管改良酸性羅氏培養(yǎng)基上（珠海貝索生物技術(shù)有限公司），37℃培養(yǎng)。分枝桿菌分離培養(yǎng)在各流調(diào)點進行，陽性培養(yǎng)物送河南省結(jié)核病參比實驗室進行菌型鑒定、藥敏試驗及菌株分型。

4．菌型鑒定：河南省結(jié)核病參比實驗室刮取培養(yǎng)管內(nèi)的培養(yǎng)物，按文獻［4］規(guī)定的操作程序進行萋-尼染色和顯微鏡檢查，鑒別是否為抗酸桿菌。

對鑒別為抗酸桿菌的菌株按照文獻［3］的方法進行對硝基苯甲酸（PNB，500μl／ml）Mtb菌型鑒定。

5．菌株測序：對鑒別為非抗酸桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的菌株進行16srRNA基因測序［6］，以鑒別菌株的種屬。擴增引物序列為F：5′-CATGCAAG TCGAACGGAAAGG-3′，R：5′-CGAACAACGACAAACCA-3′。PCR反應(yīng)體系20μl，包括2×Taq PCR MasterMix［天根生化科技（北京）有限公司］5μl，模板1μl，20μmol引物F、R各0．5μl，13μl去離子水。PCR反應(yīng)條件：94℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s，共40個循環(huán)；最后72℃延伸10min；產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，目標(biāo)片段500bp。擴增產(chǎn)物送上海英俊生物技術(shù)公司測序。

6．藥敏試驗：對鑒別為結(jié)核分枝桿菌的菌株按照《全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查實施細則》進行利福平（RFP）（40μl／ml）、異煙肼（INH）（0．2 μl／ml）、乙胺丁醇（EMB）（2μl／ml）和鏈霉素（S）（4μl／ml）、對氨基水楊酸（PAS）（1μl／ml）、卡那霉素（Km）（30μl／ml），氧氟沙星（Ofx）（3μl／ml）藥敏試驗，同時按照WHO推薦的抗結(jié)核二線藥物藥敏試驗［7］進行丁胺卡那霉素（Am）（30μl／ml），卷曲霉素（Cm）（40μl／ml）的檢測。

7．北京基因型的鑒定：根據(jù)多重PCR（DTMPCR）方法鑒定菌株北京基因型，具體參照參考文獻［8］進行操作，引物 P1：5′-GGAGTCGTTGAGGG TGTTCATCAGCTCAGTC-3′，P2：5′-CGCCAAG GCCGCATAGTCACGGTCG-3′，P3：5′-GGTTGCCCACTGGTCGATATGGTGGACTT-3′。反 應(yīng) 體系為10μl，包括：0．2μmol引物P1、P2、P3（大連寶生物工程有限公司）各加1μl，2×Taq PCR Master-Mix［天根生化科技（北京）有限公司］5μl，模板1μl，去離子水1μl；PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃5min；94℃變性30s，68℃退火30s，72℃延伸3min，共25個循環(huán)；最后72℃延伸7min。菌株擴增得到761bp片段，即為北京基因型，若擴增得到1466bp片段，即屬于非北京基因型。

三、質(zhì)量控制

各流調(diào)點的實驗人員按照《全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查實施細則》的要求進行了技術(shù)培訓(xùn)，河南省結(jié)核病參比實驗室對流調(diào)點實驗室按照文獻［4-5］的要求和程序開展了痰涂片鏡檢和Mtb分離培養(yǎng)的質(zhì)量控制。各流調(diào)點痰涂片鏡檢未出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果，Mtb分離培養(yǎng)的污染率小于5%和涂陽培陰率小于10%，均符合《全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查實施細則》的實驗室質(zhì)量要求。河南省結(jié)核病參比實驗室藥敏試驗接受WHO跨國結(jié)核病參比實驗室質(zhì)量控制［9］，藥敏試驗質(zhì)量符合WHO質(zhì)量控制要求。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

按照患者初復(fù)治、年齡、性別等流行病學(xué)基礎(chǔ)資料，以及涂片、培養(yǎng)、鑒定、藥敏試驗結(jié)果等，使用SPSS 11．5統(tǒng)計軟件建立數(shù)據(jù)庫并進行統(tǒng)計學(xué)分析，分析耐藥率差異使用χ2檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、痰涂片和菌種鑒定結(jié)果

2877例可疑肺結(jié)核患者中發(fā)現(xiàn)痰涂片陽性者35例，涂片陽性率1．22%。河南省結(jié)核病參比實驗室對接收的54例培養(yǎng)陽性菌株進行了傳代，其中有1例傳代未成功。傳代成功的53例菌株經(jīng)涂片萋-尼染色鏡檢，其中發(fā)現(xiàn)4株為非抗酸桿菌，這4例均為初次涂片陰性而培養(yǎng)陽性，經(jīng)測序4株非抗酸桿菌均屬草酸桿菌科。49例抗酸陽性菌株，經(jīng)PNB試驗45株（91．84%，45／49）為 Mtb；4株（8．16%，4／49）為非結(jié)核分枝桿菌，經(jīng)測序鑒定，1株為鳥分枝桿菌，1株為胞內(nèi)分枝桿菌，2株為偶發(fā)分枝桿菌。

二、藥敏試驗結(jié)果

1．耐藥情況：經(jīng)PNB試驗，Mtb陽性的45株菌來源于45例肺結(jié)核患者中，39例為初治患者，6例為復(fù)治患者；35例為男性，10例為女性；年齡15～87歲，平均（62±19．85）歲。對獲得的 Mtb菌株進行了藥敏試驗，13例肺結(jié)核患者對1種或1種以上藥物耐藥，其中初治患者12例耐藥，復(fù)治患者僅1例耐藥。45例肺結(jié)核患者中，男性患者中初治29例，復(fù)治6例；女性患者均為初治，經(jīng)檢驗?zāi)信颊呷我荒退幝什町悷o統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝0．008，P＝0．930）（表1）。

45例肺結(jié)核患者臨床分離株對1、2、3、4種和5種抗結(jié)核藥物的耐藥率分別為13．33%（6／45）、2．22% （1／45）、6．67% （3／45）、2．22% （1／45）和2．22%（1／45）。

45例肺結(jié)核患者同時對INH和RFP耐藥者有3例（均為初治患者），耐多藥（MDR）率為6．67%；復(fù)治患者6例中僅有1例對INH耐藥；45株菌株對Am、Km和Ofx均敏感，對其他6種抗結(jié)核藥物的耐藥率順位由高到低依次為：S（20．00%）、INH（17．78%）、RFP（8．89%）、PAS（6．67%）、EMB（4．44%）和Cm（2．22%），見表2。

表1 男性和女性患者中不同類型患者的總耐藥率

表2 各種抗結(jié)核藥物在不同類型肺結(jié)核患者中的單耐藥情況

2．基因型鑒定結(jié)果：45株結(jié)核分枝桿菌經(jīng)DTMPCR鑒定為北京基因型的有41株（91．11%），非北京基因型有4株（8．89%）。北京基因型菌株中有35例來自初治肺結(jié)核患者，復(fù)治患者6例；非北京基因型菌株均來自初治患者。獲得北京基因型菌株的肺結(jié)核患者總耐藥率為29．27%（12／41），MDR率為7．32%（3／41）；非北京基因型菌株患者僅1例耐藥，為單耐S，總耐藥率25．00%。經(jīng)檢驗北京基因型與非北京基因型肺結(jié)核患者的總耐藥率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝0．032，P＝0．857）。

討 論

河南省為全國人口第一大省，結(jié)核病患者數(shù)位于全國前列，自1993年河南省在全國率先開展了“衛(wèi)生部加強與促進結(jié)核病控制項目”；1998年自籌資金開展“河南省結(jié)核病控制項目”，2001年河南省人民政府辦公廳頒布實施了《河南省結(jié)核病防治規(guī)劃（2001—2010年）》，至2005年全省126個市縣，新涂陽患者發(fā)現(xiàn)率達到70%，涂陽患者治愈率均達到85%，DOTS覆蓋率達100%，成功實現(xiàn)了DOTS策略［10］。本次調(diào)查距2000年全省結(jié)核病流調(diào)相隔10年，按照全國第五次流調(diào)方案由國家統(tǒng)一計算和抽樣，共抽取了18個地市的36個縣的調(diào)查點。36個點中有肺結(jié)核可疑癥狀者或（和）X線胸片異常者2877例進行了痰涂片檢查，涂片陽性率為1．22%；痰標(biāo)本分離培養(yǎng)后，Mtb陽性率為1．57%（45／2875）。而2000年河南省的流調(diào)顯示，共有1887例肺結(jié)核可疑癥狀者和（或）X線胸片異常者進行了痰涂片檢查和分離培養(yǎng)，涂片陽性率4．82%（91／1887），分離培養(yǎng) 獲 得 Mtb 陽 性 率 為 5．83% （110／1887）［2］。2010年與2000年比較肺結(jié)核可疑癥狀者和（或）X線胸片異常者中涂陽和菌陽率均有了較大的降低，涂陽率和菌陽率是體現(xiàn)人群中肺結(jié)核患者傳播性的重要指標(biāo)，涂陽率和菌陽率的降低顯示了河南省肺結(jié)核病流行特征的變化，也體現(xiàn)了河南省結(jié)核病防治工作取得了較好的效果。

耐藥結(jié)核病、Mtb和HIV雙重感染、流動人口已經(jīng)成為全球結(jié)核病防治的三大難題，河南省曾經(jīng)參與了兩輪WHO組織的全球結(jié)核病耐藥監(jiān)測。監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，1996年、2001年河南省總耐藥率分別為51．4%、35．3%［11］；同時1985年、1990年和2000年全國結(jié)核病流調(diào)數(shù)據(jù)［12］顯示，河南省的總耐藥率分別為47．2%（50／106）、52．2%（36／69）和29．2%（21／72），為全球耐藥結(jié)核病高負擔(dān)地區(qū)。但本次調(diào)查顯示，河南省總耐藥率28．89%，低于全球耐藥監(jiān)測和歷次流調(diào)河南省的總耐藥率，也低于全國2007年結(jié)核病耐藥基線調(diào)查［13］顯示的全國平均總耐藥率（37．79%）。本次調(diào)查的MDR率為6．67%，低于WHO耐藥監(jiān)測河南省1996年、2006年的MDR率（22．3%、12．9%），也低于全國結(jié)核病耐藥基線調(diào)查涂陽肺結(jié)核患者的MDR率（8．32%）。同時河南省近年開展的連續(xù)耐藥監(jiān)測也顯示，河南省耐藥率水平較全國水平為低［10］，并進入平穩(wěn)持續(xù)狀態(tài)，顯示這些年河南省結(jié)核病防控工作取得了一定的成果。但因河南省結(jié)核病總患者數(shù)位居全國前列，耐藥患者數(shù)仍然眾多，仍是耐藥結(jié)核病高負擔(dān)地區(qū)。

在河南省歷次流行病學(xué)調(diào)查（1985、1990、2000、2010年）均顯示Mtb耐藥順位中，抗結(jié)核藥物S和INH居于前位，特別是在初始耐藥患者中，近期連續(xù)耐藥監(jiān)測也顯示同樣結(jié)果［10］，提示河南省的臨床醫(yī)生在治療結(jié)核病患者時應(yīng)特別注意對這兩種藥物的控制使用。

本次調(diào)查結(jié)果顯示，Mtb中的北京基因型占主要地位，而北京基因型菌株與非北京型菌株未顯示與耐藥有高的相關(guān)性，同筆者其他研究相一致［8，14］。

由于本次調(diào)查中Mtb分離培養(yǎng)主要在調(diào)查現(xiàn)場進行，4株培養(yǎng)物經(jīng)鑒別為草酸桿菌，揭示了我省目前部分基層結(jié)核病實驗室開展分離培養(yǎng)的能力還需進一步提高。雖然調(diào)查點的實驗人員在調(diào)查前進行了技能培訓(xùn)，但在實際調(diào)查工作中，部分實驗室因設(shè)備設(shè)施不足，實驗人員又不能很好地控制實驗條件，不能滿足Mtb分離培養(yǎng)對實驗室設(shè)施設(shè)備和技術(shù)條件的要求，出現(xiàn)了雜菌生長而不能正確區(qū)分與鑒別的情況。這些均提示，在今后基層實驗室的能力建設(shè)中，除需對基層實驗室工作人員技術(shù)能力加強培訓(xùn)外，還需要逐步改善基層實驗室的設(shè)施設(shè)備，建立規(guī)范的Mtb分離培養(yǎng)實驗室。

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