崔曉明， 陳良建， 鄭 遙

(1西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系， 西安 710021;2中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院口腔科;3北京世紀(jì)壇醫(yī)院口腔科)

鈦及鈦合金因其良好的力學(xué)性能和生物相容性被廣泛應(yīng)用于牙種植體，種植體植入牙槽骨以后，理想的狀態(tài)是形成骨性結(jié)合。成骨細(xì)胞在種植體表面的黏附是種植體骨界面生物學(xué)反應(yīng)的第一步，對(duì)骨性結(jié)合的形成至關(guān)重要［1，2］。粗糙多孔的表面能誘導(dǎo)細(xì)胞的“接觸引導(dǎo)”［3］作用，從而有利于細(xì)胞黏附［4，5］。目前普遍認(rèn)為噴砂處理的粗糙表面較好，成為臨床常用的種植體表面粗化方法。本研究采用TiO2顆粒噴砂和粉末注射成形(MIM)兩種方法制備多孔鈦種植體，并比較成骨細(xì)胞在兩組材料表面的黏附率及黏附形態(tài)，以探索出更有利于成骨細(xì)胞黏附的種植體制備方法。

1 材料與方法

1.1 材料的分組

本試驗(yàn)所用種植體均為直徑8 mm，厚3 mm的圓形鈦片，由中南大學(xué)粉末冶金國(guó)家重點(diǎn)試驗(yàn)室提供。將鈦片分為四組，分別為Sm組(光滑組)、Sa組(噴砂組)、M1組(MIM制備，孔隙度為40%)、M2組(MIM制備，孔隙度為60%)。

1.2 材料的制備與表面處理

Sm組:選擇直徑8 mm，厚3 mm的圓形致密鈦，以320目、500目、800目水砂紙逐級(jí)打磨。先后以丙酮、無(wú)水乙醇、去離子水超聲清洗各10 min，60℃烘干箱干燥，高溫高壓消毒后備用。

Sa組:選擇直徑8 mm，厚3 mm的圓形致密鈦，以320目、500目、800目水砂紙逐級(jí)打磨。丙酮、無(wú)水乙醇超聲清洗20 min，蒸餾水清洗3遍干燥，備用。以TiO2砂對(duì)已經(jīng)砂紙打磨的鈦片表面進(jìn)行噴砂處理，至表面呈均勻的灰色。處理后，先后以丙酮、無(wú)水乙醇、去離子水超聲清洗各10 min，60℃烘干箱干燥，高溫高壓消毒后備用。

M1及M2組:粉末原料由HDH Ti(＜77μm)，TiH2(＜65μm)，NaCl(＜290μm)組成，均呈不規(guī)則形狀。將其與黏接劑(主要成分為石蠟、高密度聚乙烯和聚乙醇等)混合制粒，采用MIM技術(shù)制備生坯，經(jīng)脫鹽脫脂，在真空度為10－3Pa經(jīng)1 100℃燒結(jié)，制備孔隙度分別為40%、60%，直徑為8 mm，厚3 mm圓形鈦片。先后以丙酮、無(wú)水乙醇、去離子水超聲清洗各10 min，60℃烘干箱干燥，高溫高壓消毒后備用。

1.3 表面形貌觀(guān)察

隨機(jī)抽取4組種植體中各3片，在掃描電鏡(scanning electron microscopy，SEM)下觀(guān)察各組種植體的表面形貌。

1.4 成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)

將MG63(購(gòu)買(mǎi)于中南大學(xué)醫(yī)學(xué)試驗(yàn)中心)成功復(fù)蘇后于5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48 h換液一次，培養(yǎng)液為低糖DMEM培養(yǎng)液(含10%已滅活小牛血清)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底后，用0.25%胰酶消化1 min，當(dāng)細(xì)胞開(kāi)始收縮變圓時(shí)倒去消化液，加入含10%小牛血清的培養(yǎng)基終止消化，然后用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，按1∶3傳代。倒置顯微鏡下觀(guān)察成熟MG63的形態(tài)。

1.5 種植體表面成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察

以0.25%胰酶消化MG63，以10%小牛血清的DMEM調(diào)整至濃度為1.5×104個(gè)/ml的懸液，用加樣器取2 ml細(xì)胞懸液分別接種于放有4組鈦種植體的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每樣本設(shè)5復(fù)孔，培養(yǎng)8 d后用倒置顯微鏡觀(guān)察種植體邊緣成骨細(xì)胞的形態(tài)。吸去培養(yǎng)液，加4℃預(yù)冷的2.5%戊二醛固定，4℃保存。酒精梯度脫水，臨界點(diǎn)干燥，噴金，將種植體置于掃描電鏡下觀(guān)察成骨細(xì)胞在種植體表面的黏附形態(tài)。

1.6 種植體表面成骨細(xì)胞黏附率的測(cè)定

以0.25%胰酶消化MG63，以10%小牛血清的DMEM調(diào)整至濃度為1.5×104個(gè)/ml的懸液，用加樣器取2 ml細(xì)胞懸液分別接種于放有4組鈦種植體的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每樣本設(shè)5復(fù)孔，分別在培養(yǎng)第4，8天后吸去培養(yǎng)液并用PBS沖洗3次，每孔加入無(wú)血清的DMEM及 MTT，再培養(yǎng)4 h，加三聯(lián)液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%十二烷基硫代硫酸鈉25 g、5%異丁醇12.5 ml、0.012 mol/L 鹽酸0.3 ml，加三蒸水補(bǔ)足250 ml)，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，吸取各孔培養(yǎng)液于490 nm酶聯(lián)免疫儀(Bio－Tek公司)測(cè)定吸光度值(optical density，OD)。OD值與所測(cè)培養(yǎng)孔中MG63濃度成正比，從而能夠準(zhǔn)確反映各組成骨細(xì)胞黏附率之間的關(guān)系。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 種植體表面形貌

2.1.1 肉眼觀(guān)察 Sm組表面銀白色金屬光澤，表面劃痕均勻一致;Sa組表面呈深灰色，無(wú)金屬光澤，表面孔隙形態(tài)較規(guī)則;MIM組表面呈淺灰色，孔隙形狀不規(guī)則，M2組較M1組孔隙明顯增多。

2.1.2 掃描電鏡觀(guān)察 由圖1(見(jiàn)第86頁(yè))可看出，Sm組表面可見(jiàn)方向一致的劃痕，偶見(jiàn)裂隙和點(diǎn)狀凹陷;Sa組表面呈多級(jí)孔洞，蜂窩狀，表面顏色、形態(tài)均勻一致，孔徑分布在80－300μm;M1組表面粗糙，各個(gè)孔洞獨(dú)立存在，未見(jiàn)連通孔結(jié)構(gòu)，孔徑主要分布在50－400μm;M2組孔隙增多，呈蜂窩狀，形成連通孔結(jié)構(gòu)，孔徑主要分布在50－400μm。

2.2 MG63 光鏡觀(guān)

倒置顯微鏡下觀(guān)察成熟MG63的形態(tài)顯示，細(xì)胞呈梭形，胞體舒展鋪于瓶底，彼此成條索狀排列，胞質(zhì)豐富，胞核卵圓(圖2)。

圖2 體外培養(yǎng)成熟MG63 (×100)Fig 2 Morphology of mature MG63 cultured in vitro(×100)

2.3 MG63在種植體表面黏附形態(tài)

在倒置光學(xué)顯微鏡下，4組材料邊緣成骨細(xì)胞在數(shù)量上及形態(tài)上無(wú)明顯差。材料邊緣成骨細(xì)胞數(shù)量較多，部分細(xì)胞伸出偽足，緊貼材料側(cè)面垂直生長(zhǎng)，形態(tài)及大小與其他部位細(xì)胞無(wú)明顯差別(圖3)。

由圖4可看出，在SEM下Sm組成骨細(xì)胞平鋪于材料表面，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或多邊形，偽足少，扁平，因點(diǎn)狀凹陷直徑過(guò)小，細(xì)胞跨過(guò)凹陷的兩端平鋪于表面，細(xì)胞排列方向與表面劃痕無(wú)特定關(guān)系。Sa組成骨細(xì)胞伸展良好，呈扁平狀，形態(tài)各不相同，在材料表面孔徑與MG63大小相當(dāng)?shù)目紫秲?nèi)，細(xì)胞呈橋狀生長(zhǎng)，偽足不多，附著在孔洞邊緣，與材料表面結(jié)合較緊密。M1組成骨細(xì)胞多呈不規(guī)則多邊形，伸展良好，偽足較多，牢固附著在材料表面或深入孔洞內(nèi)，形成細(xì)胞橋。M2組成骨細(xì)胞多呈不規(guī)則多邊形，完全伸展，多個(gè)偽足牢固附著在材料表面及孔壁之上。

圖3 種植體邊緣MG63(×100);Fig 3 Morphology of MG63 in the surface of implants

2.4 各組材料對(duì)成骨細(xì)胞黏附率的影響

由表1可見(jiàn)，培養(yǎng)4 d后Sa、M1、M2組吸光度值均高于Sm組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Sa組與M1組之間差異不明顯(P＞0.05);M2組與Sa、M1組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。培養(yǎng)8 d后，各組較4 d時(shí)黏附率均有所增加，Sa、M1、M2組吸光度值仍高于Sm;Sa組與M1組之間差異不明顯(P＞0.05);M2組與Sa、M1之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

鈦及鈦合金因其良好的力學(xué)性能和生物相容性被廣泛應(yīng)用于牙種植體，現(xiàn)在用的鈦種植體大多為全致密型，具有生物活性差、彈性模量與骨組織不匹配等缺點(diǎn)。這就導(dǎo)致了種植體植入后愈合時(shí)間較長(zhǎng)，在這段時(shí)間里種植體容易松動(dòng)、下沉和脫位，影響成功率［6］。因此制備出具有高生物活性的，彈性模量與骨組織相匹配的種植體成為種植義齒領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。

表面具有多孔結(jié)構(gòu)的鈦種植體能夠有效降低材料的彈性模量，且粗糙多孔的表面結(jié)構(gòu)能夠促進(jìn)細(xì)胞的黏附，而成骨細(xì)胞在種植體表面的黏附對(duì)種植體骨界面骨性結(jié)合的形成至關(guān)重要，因此制備出表面粗糙多孔的鈦種植體成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者們的研究方向［7，8］。

具有粗糙表面的種植體與骨組織的結(jié)合面積及結(jié)合強(qiáng)度均大于光滑表面的種植體，而具有高孔隙度多孔結(jié)構(gòu)材料因其開(kāi)放性微孔及內(nèi)部連通孔結(jié)構(gòu)的存在亦有利于血管和神經(jīng)長(zhǎng)入，從而有利于骨性結(jié)合的形成［9］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)論4 d還是8 d，Sa、M1、M2組黏附率均高于Sm組，而M2組的黏附率又高于Sa、M1組，這一結(jié)果驗(yàn)證了高孔隙度且具有連通孔結(jié)構(gòu)的種植體表面更有利于成骨細(xì)胞的增殖黏附。分析原因?yàn)?孔隙度高的材料增加了種植體的表面積，從而為成骨細(xì)胞的黏附增殖提供了足夠的場(chǎng)所，因而增加了黏附率;孔隙度高的連通孔結(jié)構(gòu)具有寬大的內(nèi)部空間和表面積，有利于營(yíng)養(yǎng)成分的滲透，代謝產(chǎn)物的排出，從而有利于成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖4 聯(lián)合培養(yǎng)8 d后各組成骨細(xì)胞黏附形態(tài) (SEM，×1 000)Fig 4 The adhesion form of MG63 after cultured 8 d (SEM，×1 000)

表1 成骨細(xì)胞與材料聯(lián)合培養(yǎng)4、8 d后各組吸光度值Tab 1 The OD value in 4 groups after cultured with MG63 for 4 d and 8 d

本研究中，由成骨細(xì)胞在各組材料表面不同的黏附形態(tài)分析可知:Sa、M1、M2組成骨細(xì)胞在黏附形態(tài)與定向生長(zhǎng)兩個(gè)方面均優(yōu)于Sm組，說(shuō)明粗糙的表面結(jié)構(gòu)更有利于成骨細(xì)胞的黏附。這與大多國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)果相符。這是因?yàn)榇植诘谋砻娼Y(jié)構(gòu)能為成骨細(xì)胞的黏附提供更大的接觸面積，而表面積與表面張力的乘積就是表面能，所以高孔隙度的種植體具有更高的表面能，Sergo等［10］發(fā)現(xiàn)高表面能對(duì)成骨細(xì)胞的吸附具有積極作用。Sa組與M1組在細(xì)胞形態(tài)上相仿，這可能由于二者在孔徑與孔隙度上均相差不多有關(guān)。M2組成骨細(xì)胞在形態(tài)與定向生長(zhǎng)兩方面均優(yōu)于Sa、M1組，分析原因是該組孔隙度較高存在開(kāi)放性的微孔且SEM顯示其內(nèi)部具有連通孔結(jié)構(gòu)。開(kāi)放性的微孔對(duì)骨的內(nèi)向生長(zhǎng)是必需的，也使多孔支架基底廣泛的體液交換成為可能。連通孔結(jié)構(gòu)不僅為細(xì)胞的遷移和內(nèi)向生長(zhǎng)提供了更多的生長(zhǎng)空間，同時(shí)因毛細(xì)血管的長(zhǎng)入也有利于孔隙之間營(yíng)養(yǎng)的交換、細(xì)胞外基質(zhì)的沉積、氧氣的進(jìn)入及代謝產(chǎn)物的排出，而細(xì)胞外基質(zhì)在以蛋白質(zhì)為介導(dǎo)的細(xì)胞黏附機(jī)制［11，12］中起著決定性的作用。另外，連通孔結(jié)構(gòu)具有更好的鎖水作用，而親水性表面更有利于細(xì)胞的黏附［13，14］。

粗糙多孔的種植體表面結(jié)構(gòu)更有利于成骨細(xì)胞的黏附，而孔徑和孔隙度在骨的定向生長(zhǎng)中起關(guān)鍵性的作用。對(duì)于孔徑的大小，大多學(xué)者通過(guò)理論研究及體內(nèi)體外試驗(yàn)認(rèn)為當(dāng)孔徑與成骨細(xì)胞(直徑大約為30μm)直徑大小相當(dāng)或者大于成骨細(xì)胞直徑時(shí)，有利于成骨細(xì)胞向孔內(nèi)生長(zhǎng)。試驗(yàn)中顯示在孔徑小于MG63的孔內(nèi)，細(xì)胞無(wú)法內(nèi)向生長(zhǎng)，只能跨過(guò)孔隙平鋪于表面;在孔徑與MG63相似的孔內(nèi)，細(xì)胞以偽足附著于孔壁，呈橋狀生長(zhǎng);在孔徑明顯大于MG63的孔隙內(nèi)，細(xì)胞以多個(gè)細(xì)長(zhǎng)的偽足牢固附著于孔壁。在孔內(nèi)可見(jiàn)細(xì)胞環(huán)形生長(zhǎng)，部分呈垂直向生長(zhǎng)。本試驗(yàn)結(jié)果與國(guó)內(nèi)外學(xué)者的結(jié)論相符合［15，16］。而對(duì)于孔隙度，國(guó)內(nèi)外研究尚存在爭(zhēng)議。試驗(yàn)顯示，對(duì)于采用MIM技術(shù)制備的多孔鈦種植體，高孔隙度更有利于細(xì)胞的黏附，但孔隙度的增高必然造成材料強(qiáng)度的降低。如何調(diào)節(jié)材料的孔隙度和強(qiáng)度，使之達(dá)到臨床上的最佳要求，還需要通過(guò)大量的后續(xù)試驗(yàn)加以研究。

多孔材料表面的孔徑和孔隙度是影響成骨細(xì)胞黏附及骨性結(jié)合的最主要的參數(shù)。目前臨床應(yīng)用較廣的噴砂制備方法既不能有效實(shí)現(xiàn)孔隙度和孔徑可控，又不能形成對(duì)成骨細(xì)胞黏附極其重要的連通孔結(jié)構(gòu)。MIM技術(shù)是一種從塑料注射成形行業(yè)中引申出來(lái)的新型粉末冶金近凈成形技術(shù)。以它來(lái)制備多孔鈦種植體可通過(guò)控制造孔劑的量調(diào)節(jié)孔隙度的大小，形成具有大孔徑連通孔結(jié)構(gòu)的不同孔隙度的多孔鈦種植體，實(shí)現(xiàn)了孔隙度和孔徑可控。它在成骨細(xì)胞的黏附率、黏附形態(tài)及生長(zhǎng)方向各方面均優(yōu)于目前臨床應(yīng)用較多的噴砂制備方法，為制備新型多孔鈦種植體提供了理論依據(jù)。

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