王 道，廖高鵬，肖亞梅

(湖南師范大學生命科學學院，教育部蛋白質(zhì)化學和魚類發(fā)育生物學重點實驗室，中國 長沙 410081)

巖藻多糖降解酶主要包括3種酶：巖藻多糖酶、α-L-巖藻糖苷酶和硫酸酯酶．α-L-巖藻糖苷酶是一種催化含巖藻糖基的糖蛋白、糖脂等生物活性大分子水解酶的溶酶體酸性水解酶，主要負責水解巖藻多糖糖苷鍵的非還原末端的L-巖藻糖殘基，釋放出巖藻糖[1]，廣泛分布于人體和動物的組織細胞、血液和體液中[2-4]．FUCA1(α-L-巖藻糖苷酶-1)屬于糖基水解酶29家族的一員．FUCA1作為一種同型四聚體，負責水解和減少在各種組織中的糖蛋白的部分碳水化合物．研究證實α-L-巖藻糖苷酶基因是小鼠性腺發(fā)育的相關基因，小鼠精子頂體中的N-乙?；?葡萄糖胺苷酶，被證明參與精卵識別[5]．黃鱔(Monopterusalbus)，屬于硬骨魚綱(Osteichthyes)，合鰓目(Synbranchiformes)，為溫帶淡水魚類，擁有復雜的生殖發(fā)育過程．黃鱔從受精卵發(fā)育到首次性成熟時是雌性個體，隨后逐漸地發(fā)育為雄性個體，中間的過渡時期為雌雄同體．黃鱔從雌到雄的轉變過程被稱為性逆轉．黃鱔這種獨特的天然生理現(xiàn)象使它成為研究魚類性別控制機理的一種重要動物．本研究選用黃鱔(Monopterusalbus)為研究材料，研究FUCA1基因在魚類不同生殖發(fā)育階段中的分化表達模式，以進一步了解和發(fā)現(xiàn)巖藻糖苷酶基因在黃鱔性逆轉調(diào)控中的作用，為探究魚類的性別決定機制提供新線索．

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從湖南省長沙市水產(chǎn)批發(fā)市場購買實驗用黃鱔．選取已經(jīng)達到性成熟階段的雌、雄黃鱔(雌雄各3尾)，用解剖刀斷頭放血后，迅速用鑷子摘取黃鱔的雌、雄性腺組織，并且用液氮處理后，凍存于-80 ℃的冰箱中備用．

1.2 主要試劑

FUCA1特異引物由上海生物工程公司合成；總RNA提取試劑盒E.Z.N.A Total RNA KitⅡ購自Omega公司；反轉錄試劑盒RevertAid First strand cDNA Sythesis Kit購自Fermentas 公司；SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 試劑盒購自Clontech公司；UniQ-10柱式DNA膠回收試劑盒購自上海生物工程公司；PCR Mix 購自北京天根生化科技有限公司；pMD18-T載體購自Takara公司．

1.3 試驗方法

1.3.1 黃鱔FUCA1基因cDNA克隆 首先從黃鱔卵巢組織中用RNA提取試劑盒得到總RNA，然后根據(jù)反轉錄試劑盒(RevertAid First strand cDNA Sythesis Kit)做反轉錄反應以獲取模板cDNA．根據(jù)NCBI的genebank中已經(jīng)報道的人FUCA1基因(GenBank accession number: nm000147.4 )和鼠FUCA1(GenBank accession number: nm024243.4)共同的保守區(qū)，用軟件Primer premier 5.0設計一對簡并引物E-1和E-2(E-1：5′-TCGGGATTTGGTTGGTG-3′，E-2：5′-CTGGCAAGCTCTGTGGC-3′)．再以cDNA為模板，選用正負引物進行PCR擴增反應，PCR反應總體積為20 μL (滅菌 water 7 μL，2×Taqmix溶液10 μL，cDNA模板1 μL，正負引物各1 μL)．PCR反應條件：94 ℃預熱 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進行35 個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，最后4 ℃保存．用1.6%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測目的條帶，用小刀迅速切下目的條帶，回收純化、克隆后送上海生工公司測序．

3′端RACE方法的擴增：根據(jù)已經(jīng)獲得的黃鱔FUCA1基因的中間片段設計特異引物F3OP和F3IP(F3OP：5′-AGTGCTGCTGGAACGGAAATGAC-3′，F(xiàn)3IP：5′-TGTTGGACCGCAGCCAGC-3′)．使用試劑盒SMARTer RACE cDNA Amplification Kit獲取3′的cDNA，吸取1 μL作為模板，用F3OP和10×UPM混合引物(long 0.4 μmol/L 5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′，short 2 μmol/L：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′)進行PCR擴增反應，PCR總體積20 μL (滅菌 water 7 μL，2×Taqmix溶液10 μL，cDNA模板1 μL,正負引物各1 μL)，PCR反應條件:94 ℃預熱5 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，5 個循環(huán)； 94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s ，72 ℃ 2 min，5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，25個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min，4 ℃保存．為了提高擴增條帶的特異性，將得到的PCR產(chǎn)物稀釋45倍，用移液器取1 μL為模板，然后用引物F3IP和NUP(10 μmol/L：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)進行PCR擴增反應，總體積20 μL ，PCR反應條件：94 ℃預熱5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存．用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳掃膠，用小刀快速切下目的條帶，克隆后送上海生工公司測序．

1.3.2 RT-PCR檢測FUCA1基因的表達 已經(jīng)達到性成熟的黃鱔被斷頭放血數(shù)分鐘后，立即用鑷子摘取2種不同的性腺組織：卵巢和精巢．用OMEGA公司的總RNA提取試劑盒提取不同性腺組織的總RNA．根據(jù)先前已經(jīng)克隆出來的黃鱔FUCA1基因的核苷酸序列用Primer premier 5.0軟件設計mRNA水平上所需要的表達引物E-1、E-2(表1)．進行PCR反應總體積為20 μL (2×Taqmix溶液10 μL，water 6 μL，cDNA模板2 μL，正負特異引物各1 μL)．PCR反應條件：94 ℃預熱5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進行35 個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃ 保存．最后用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測目的條帶，以β-actin為實驗內(nèi)參．

表1 PCR表達引物及其引物序列Tab.1 The primers and their sequences of PCR

2 結果

2.1 黃鱔FUCA1基因核苷酸和氨基酸序列

采用從黃鱔性腺提取的總RNA進行RT-PCR．按照已經(jīng)報道的人FUCA1基因(GenBank accession number: nm000147.4)和鼠FUCA1基因(GenBank accession number: nm024243.4)保守序列設計簡并引物E-1和E-2．用引物E-1和E-2擴增出FUCA1部分基因片段，獲得1 200左右的DNA帶，克隆后酶切鑒定、測序，序列長度為1 175 bp序列(圖1)．利用在線軟件SMART對本實驗所克隆出來的FUCA1基因部分序列進行對比分析，其結果表明該序列包含了3個跨膜結構域(圖2)．

圖1 黃鱔FUCA1基因核苷酸及蛋白質(zhì)序列Fig.1 FUCA1 gene nucleotide and amino acid sequence of ricefield eel cDNA

圖2 SMART軟件分析圖Fig.2 SMART software analysis chart

2.2 FUCA1在黃鱔雌雄性腺組織mRNA表達水平檢測結果

提取黃鱔的卵巢、精巢，先后進行了3次重復的RT-PCR實驗，檢測了FUCA1基因在不同組織中的表達，并使用生物軟件GEL-PRO對3次PCR產(chǎn)物的凝膠圖進行了半定量灰度分析.PCR擴增圖譜顯示，F(xiàn)UCA1基因可在黃鱔的精巢和卵巢組織中檢測到，其在卵巢中的mRNA的表達量高于在精巢組織(圖3)．

圖3 FUCA1基因在黃鱔2種不同組織中mRNA水平的表達(1.精巢；2.卵巢)Fig.3 The mRNA expression of FUCA1 in ricefield eel different tissues(1.testis; 2.ovary)

3 討論

目前哺乳動物的Sry基因、雞的Dmrt1基因、青鳉Dmy基因和爪蟾Dm-w基因被認為是脊椎動物性別決定的關鍵基因，研究人員通過分析比對這些脊椎動物的外顯子-內(nèi)含子基因結構，有趣地發(fā)現(xiàn)，青鳉的Dmrt1、Dmy和爪蟾的Dm-w、Dmrt1基因都含有非編碼型的第一外顯子，而小鼠和雞的Dmrt1卻沒有[6]．黃鱔是一類雌性先熟的雌雄同體魚類，其性別發(fā)育方向為單方向進行，隨著卵巢的敗育，逐漸過渡到雄性發(fā)育[ 7-8]．20世紀90年代初，劉建康在研究黃鱔繁殖習性中首次報道了黃鱔的性逆轉現(xiàn)象[9]．但是到目前為止，我們對其性逆轉的分子發(fā)育機制還不甚了解．最新實驗研究表明，動物的性別決定是一個由多基因共同調(diào)控的復雜過程．在人和哺乳動物性別決定機制方面，位于Y染色體上的Sry基因被認為是性別決定的關鍵基因[10-11]．周榮家等以人Sry基因序列合成PCR引物，以黃鱔DNA為模板進行PCR擴增，并經(jīng)隨機引物法DIG標記的人Sry基因探針進行Southern印跡雜交，結果表明黃鱔基因組存在人的Sry同源基因[12]．在黃鱔的基因組以及cDNA中克隆了兩個Sox9基因，這兩個基因在黃鱔3種性腺中的表達圖式一致，但是特異地出現(xiàn)在具有雙向分化潛能的性腺上皮的外側，這提示了它們在黃鱔性反轉的性腺分化中有著重要的作用[13-14]．此家族的Sox17基因主要在黃鱔的3種性腺、腦、脾中表達，表明可能參與黃鱔性逆轉[15]．商璇等也發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白93不但具有管家基因的功能，還涉及參與了調(diào)控性腺分化等發(fā)育過程[16]．在黃鱔的不同發(fā)育時期，熒光定量技術顯示了芳香化酶基因P450arom和P45011β表達量存在差異，進一步說明類固醇在黃鱔性逆轉過程中起著重要作用[17]．Dmrt1b基因是目前為止唯一一個硬骨魚類中發(fā)現(xiàn)的，在青鳉魚中起性別決定的基因．研究表明黃鱔中Dmrt1基因在成體性腺中特異表達，且在性逆轉的過程中逐漸升高，說明該基因可能在性反轉的過程中有重大的作用[18]．黃鱔性腺發(fā)育過程中，呂道遠等用RNA反義探針原位雜交技術，對vasa基因的表達也進行了研究，結果顯示黃鱔的雄性生殖細胞可能起源于雌性階段卵巢被膜中的原始生殖細胞[19]．在線蟲和果蠅中，vasa基因缺失會導致阻礙卵子正常功能，精子受阻也發(fā)生在vasa基因被敲除的小鼠中[20]．本實驗室之前研究工作證實ERK和JNK在黃鱔卵原細胞和精原細胞均有表達，提示在黃鱔卵母細胞發(fā)育成熟過程中，ERK和JNK可能起著重要的調(diào)控作用[21]．根據(jù)陳麗莉等報道JNK1基因在黃鱔雌性性腺組織中的表達量要遠遠高于雄性性腺組織中的表達量，而JNK3基因在金魚和斑馬魚雌、雄性腺中的表達結果是精巢組織中有顯著的表達，而在卵巢中未檢測到[22]．所有這些都提示著：JNKs家族參與了魚類的性別決定和性腺發(fā)育的調(diào)控過程[23]．

魚類的FUCA1基因研究甚少，F(xiàn)UCA1基因在黃鱔中卵巢的表達量高于精巢，提示FUCA1基因與黃鱔的性逆轉可能有密切關聯(lián)．同時FUCA1還能夠造成SSEA的表達量的降低，推測FUCA1可能是調(diào)控SSEA的關鍵酶．肖亞梅等用免疫組化對黃鱔雌雄性腺SSEA的組織細胞定位，表明SSEA在黃鱔雄性性腺中的表達量高于在雌性性腺中的[23]．在黃鱔自然性逆轉過程中，是否通過α-L-巖藻糖苷酶這種聚糖途徑對下游的靶基因SSEA的表達調(diào)節(jié)來控制其生殖發(fā)育呢？α-L-巖藻糖苷酶在黃鱔性逆轉過程中的作用機制有待于更加深入的研究．

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