蘇利霞,楊華武,趙 瑜,朱卓越 ,陳 雄,楊陟華,朱茂祥

(1.湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心,中國(guó) 長(zhǎng)沙 410014； 2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，中國(guó) 北京 100850)

煙草作為一種特殊商品，滿足了消費(fèi)者生理和心理方面的需要，但流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示吸煙對(duì)人體健康有一定影響．隨著研究的深入，醫(yī)學(xué)界對(duì)吸煙與健康的影響也產(chǎn)生了迷惑與分歧，吸煙對(duì)健康的危害變得模棱兩可[1]．眾所周知，吸煙對(duì)人體健康的影響最終是體現(xiàn)在生物體上[2]，建立生物指標(biāo)來檢測(cè)和評(píng)價(jià)卷煙對(duì)生物體的效應(yīng)，對(duì)低危害卷煙產(chǎn)品的前期開發(fā)和卷煙安全性評(píng)價(jià)是很有意義的．作者采用離體細(xì)胞培養(yǎng)的方法來檢測(cè)煙氣濃縮物的細(xì)胞毒性、動(dòng)式被動(dòng)吸煙小鼠急性毒性試驗(yàn)來檢測(cè)煙氣的急性毒性，共測(cè)定國(guó)內(nèi)外20個(gè)不同品牌的卷煙[3]，試驗(yàn)采用2個(gè)生物學(xué)指標(biāo)：細(xì)胞死亡率和小鼠半數(shù)死亡時(shí)間，將該數(shù)據(jù)制成加權(quán)數(shù)值表，來初步評(píng)價(jià)卷煙煙氣的有害生物效應(yīng)和煙氣中的亞硝胺、氫氰酸含量的相關(guān)性．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用煙采用在市面上隨機(jī)抽樣提供，每支煙質(zhì)量為0.90～0.92 g．

1.2 主要試劑

無(wú)血清的LHC-12 培養(yǎng)液(Gibco 公司)，LHC基礎(chǔ)培養(yǎng)液(Biofluids Biobource INC)，胰蛋白酶(Gibco 公司)，胎牛血清(北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所)，二甲基亞砜(DMSO，Sigma 公司)，噻唑蘭(MTT，Amersham LIFE SCIENCE)，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)(Sigma 公司)，乙腈(Merck公司)，乙酸(Merck公司)，乙酸胺(Merck公司)，其余均為市售分析純?cè)噭?/p>

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

JJD100 型單通道吸煙機(jī)(鄭州煙草研究所)，MOODEL 2300 CO2孵箱(Sheldon制造有限公司)，月壇牌潔凈工作臺(tái)(北京冠鵬凈化設(shè)備有限公司)，TDL-5T臺(tái)式離心機(jī)(重慶光學(xué)儀器廠)，LXJ-64-01型離心機(jī)(北京醫(yī)療儀器修理廠)，KUBOTA 6930型低溫離心機(jī)(久保田商事株式會(huì)社)，Thermo Forma低溫冰箱(Thermo Electron 公司)，MCC/340 P酶標(biāo)儀(Multiakan公司), HH-SY21-Ni4C型電熱恒溫水浴鍋(北經(jīng)長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司), SARTORIUS BS210S型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司),API3000液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(AB SCIEX公司)．AAⅢ型連速流動(dòng)分析儀(德國(guó)BRAN&RU BBE公司)．

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

永生化人支氣管上皮細(xì)胞系BEP2D，以LHC-8無(wú)血清培養(yǎng)液(LHC-8 SERUM-FREE MEDIUM with GLUTAMINE)培養(yǎng),接種于25 cm2或75 cm2的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，以95%相對(duì)濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%(下同)的CO2、37 ℃在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育；細(xì)胞每周傳代1次，傳代后2天換1次液．

1.5 卷煙煙氣凝集物(CSC)制備

JJD100 型單通道吸煙機(jī)設(shè)定為1 口/min，分別經(jīng)過5 mL 有機(jī)相(95%的乙醇) 和5 mL 無(wú)機(jī)相(LHC-12 培養(yǎng)液)收集20 支卷煙的煙氣，分裝后于-80 ℃貯存?zhèn)溆茫?/p>

1.6 MTT 法檢測(cè)

把培育的細(xì)胞用微孔濾膜過濾除菌后，以LHC-8培養(yǎng)液稀釋至所需濃度進(jìn)行染毒．收集處于指數(shù)生長(zhǎng)的BEP-2D細(xì)胞，按109個(gè)/L接種96孔培養(yǎng)板中，其中1排孔作為陰性對(duì)照，不作任何處理；另1排孔作為空白對(duì)照，分別進(jìn)行試驗(yàn)煙和對(duì)照煙的細(xì)胞染毒，每種卷煙設(shè)計(jì)10個(gè)染毒劑量．用2.5 g/L胰蛋白酶消化BEP2D細(xì)胞,并且準(zhǔn)確計(jì)數(shù)．然后用LHC-8培養(yǎng)液稀釋單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔8 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μL;將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在37 ℃、5%CO2和95%相對(duì)濕度條件下，培養(yǎng)24 h；然后以不同濃度CSC 對(duì)細(xì)胞染毒，每個(gè)劑量設(shè)4個(gè)平行樣，終體積仍保持200 μL， 染毒培養(yǎng)72 h后，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL,37 ℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO,震蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解．選擇570 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔OD值，記錄結(jié)果[4]．

1.7 TSNA含量檢測(cè)

將收集了主流煙氣粒相物的濾片置于小玻璃瓶中，加入100 μL 5 mg/L的內(nèi)標(biāo)混合溶液和10 mL的0.1 mol/L乙酸銨水溶液，封好玻璃瓶，置于回旋震蕩器上以180 r/min轉(zhuǎn)速振蕩萃取30 min；分別用1 mL 的甲醇和水先后潤(rùn)洗固相萃取小柱，移取1.0 mL萃取液，用120 μL的1.0 mol/L的氫氧化鈉溶液將萃取液調(diào)為堿性，堿性液上OASIS MCX (30 mg)固相萃取柱，用1 mL水淋洗，然后用1.0 mL 50%甲醇(體積分?jǐn)?shù))的水溶液將分析物洗脫，洗脫液裝入液相進(jìn)樣小瓶，以備LC/MS/MS分析[5]．

1.8 HCN含量檢測(cè)

按YC/T 29-1996標(biāo)準(zhǔn)抽取5支卷煙后，將收集了主流煙氣粒相物的濾片置于小玻璃瓶中，加入50 mL 0.1 mol/L NaOH溶液常溫下震蕩30 min，用裝有過濾頭5 mL一次性針筒抽取濾液，裝入樣品瓶?jī)?nèi)進(jìn)行連速流動(dòng)分析；用裝有30 mL 0.1 mol/L NaOH溶液的吸收瓶撲集5支卷煙主流煙氣氣相中的HCN，吸畢，用0.1 mol/L NaOH溶液淋洗吸收瓶與主流煙氣接觸的部分，合并撲集液與淋洗液，用0.1 mol/L NaOH溶液定容至50 mL，取約2 mL裝入樣品瓶中進(jìn)行連速流動(dòng)分析；根據(jù)吸光度和工作曲線計(jì)算撲集液中的HCN濃度，卷煙煙氣中的HCN釋放量為粒相(濾片)與氣相(吸收瓶)中HCN測(cè)定量之和[6]．

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠急性毒性暴露卷煙煙氣的半數(shù)死亡時(shí)間按急毒大小排序

表1 小鼠急性毒性暴露卷煙煙氣的半數(shù)死亡時(shí)間按急毒大小排序表

2.2 樣品煙氣濃縮物按細(xì)胞毒性大小排序

采用相同的實(shí)驗(yàn)條件，分別對(duì)20個(gè)不同品牌的卷煙進(jìn)行動(dòng)物急性毒性、細(xì)胞閾劑量及細(xì)胞半數(shù)致死劑量測(cè)定比較，進(jìn)行One-Sample T Test 分析(表2),發(fā)現(xiàn)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)協(xié)同性差異．

2.3 按加權(quán)綜合毒性大小排序

采用2個(gè)生物學(xué)指標(biāo)，并采用加權(quán)法來比較20個(gè)品牌的卷煙煙氣的有害生物學(xué)效應(yīng)，見表3．

表2 樣品煙氣濃縮物毒性列表(按急毒大小排序)

表3 卷煙煙氣加權(quán)綜合毒性列表

2.4 樣品煙氣濃縮物細(xì)胞生物加權(quán)綜合毒性大小和煙氣中的亞硝胺含量和氫氰酸含量測(cè)定結(jié)果

從表4、圖1、圖2中可以看出：不同品牌的卷煙煙氣的有害生物學(xué)效應(yīng)存在一定的差異，在進(jìn)行卷煙安全性評(píng)價(jià)時(shí)，生物加權(quán)綜合毒性大小與亞硝胺、氫氰酸含量沒有明顯的線性關(guān)系．造成這種現(xiàn)象的原因可能為： CSC是一種混合物，各種有害組分之間也可能是一種疊加或協(xié)同作用[9-14]，卷煙的有害生物效應(yīng)與單個(gè)化合物組分的含量關(guān)系并不很密切．

表4 樣品煙氣濃縮物細(xì)胞生物加權(quán)綜合毒性和煙氣中的亞硝胺、氫氰酸含量

圖1 生物加權(quán)綜合毒性大小與總TSNA變化關(guān)系圖Fig.1 The relationship between bio-weighted composite toxicity total with TSNA

圖2 生物加權(quán)綜合毒性與總HCN變化圖Fig.2 The relationship between bio-weighted composite toxicity with HCN

3 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)卷煙煙氣冷凝物(CSC)中具有代表性的TSNA、HCN的有害成分細(xì)胞毒性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TSNA、HCN與 CSC都具有體外細(xì)胞毒性，但是不同品牌的卷煙煙氣的有害生物學(xué)效應(yīng)存在一定差異，在進(jìn)行卷煙安全性評(píng)價(jià)時(shí)，生物加權(quán)綜合毒性大小與亞硝胺、氫氰酸含量沒有明顯的線性關(guān)系．造成這種現(xiàn)象的原因可能為： CSC是一種混合物，各種有害組分之間可能存在一種疊加或協(xié)同作用，卷煙的有害生物效應(yīng)與單個(gè)化合物組分的含量關(guān)系并不很密切．因此煙草行業(yè)和社會(huì)公眾需要科學(xué)、全面、客觀地評(píng)價(jià)卷煙煙氣危害性，煙草行業(yè)也要致力于降低煙氣中的有害成分．

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