楊賢子 程甜甜 駱志國 蔣 飛 柴海霞 張文杰

信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal transducer and activator of transcription，Stat)為一類雙功能分子，即參與信號傳導(dǎo)，又激活基因轉(zhuǎn)錄。Stat6分子可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞分化增殖、誘導(dǎo)凋亡而對靶細(xì)胞發(fā)揮重要作用［1］。用半定量凝膠遷移法(EMSA)將人直結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29和Caco-2分為不同的Stat6活化表型，HT-29指定為Stat6high表型，而Caco-2為Stat6null表型。與HT-29細(xì)胞相比，Caco-2細(xì)胞表現(xiàn)出較高的自然凋亡率［2］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)高自然凋亡率的Stat6null表型的Caco-2細(xì)胞表現(xiàn)出較高的化療敏感性［3］。重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液(endostar，YH-16，恩度)能夠特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和誘導(dǎo)其凋亡，從而直接發(fā)揮抑制血管生成和間接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞休眠或退縮的作用［4，5］。本研究旨在觀察不同Stat6表型的直結(jié)腸癌細(xì)胞對恩度聯(lián)合化療藥物敏感性的差異，為直結(jié)腸癌化療和分子靶向治療療效的評價提供1種潛在的指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

本實驗所用結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29和Caco-2購自美國典藏中心(ATCC)，用含10%小牛血清、青霉素100 U/ml和鏈霉素100 mg/ml的RPMI-1640培養(yǎng)液(JRH)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要的試劑

人重組內(nèi)皮抑制素注射液［商品名:恩度，150 mg/ml，惠贈于先聲藥業(yè)(國藥準(zhǔn)字 S20050088)］于－4℃保存，使用時加入生理鹽水稀釋或加入完全培養(yǎng)基至所需濃度。用于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞早期凋亡的試劑盒(包括Annexin V和PI染液)購自深圳晶美生物技術(shù)有限公司。氟尿嘧啶注射液(5-Fu，國藥準(zhǔn)字H50020128)，西南藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格10 ml∶0.25 g。奧沙利鉑注射液(艾恒，OXP，國藥準(zhǔn)字H20000337)，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格50 mg?；谖覀円郧暗难芯拷Y(jié)果，本試驗中加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中的5-Fu和奧沙利鉑的化療藥物濃度分別為100 μg/ml，45 μg/ml［3］。

1.3 MTT檢測恩度聯(lián)合化療藥物對癌細(xì)胞的增殖抑制

選取對數(shù)生長期的Caco-2和HT-29細(xì)胞，制備成濃度為6×104/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μl。實驗設(shè)試劑對照組、腫瘤細(xì)胞對照組及4個實驗組(因本課題的實驗設(shè)試劑對照組和腫瘤細(xì)胞對照組的試驗結(jié)果與我們前期的研究結(jié)果相近［3］，故在本文的結(jié)果中未展示)。4個實驗組分別為恩度單藥組、恩度+5-Fu(100 μg/ml)化療組、恩度+OXP(45 μg/ml)化療組、恩度 +5-Fu(100 μg/ml)+OXP(45 μg/ml)聯(lián)合化療組，其中每個實驗組中所加入恩度的終濃度為 50 μg/ml，100 μg/ml，200 μg/ml，400 μg/ml，每一濃度梯度設(shè)6個平行孔。接種于96孔培養(yǎng)板中的癌細(xì)胞先在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h使其貼壁生長。后在加入上述不同濃度的恩度和化療藥物繼續(xù)在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。于實驗終止前4 h加入MTT液20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)至實驗結(jié)束。棄上清，每孔加DMSO 100 μl后，10 min內(nèi)在全自動酶標(biāo)儀上室溫避光振蕩混勻，測定各孔波長570 nm處的光密度值(D570)。實驗重復(fù)3次，取均值。細(xì)胞生長抑制率(CI)=(1－實驗組平均D570值/細(xì)胞對照組平均D570值)×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測恩度聯(lián)合化療藥物對癌細(xì)胞早期凋亡率的影響

將對數(shù)生長的2株直結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2和HT-29細(xì)胞分別接種于6孔培養(yǎng)板上(每孔1×106個細(xì)胞)，RPMI-1640培養(yǎng)基孵育24 h后，將不同實驗組的藥物分別加入孔內(nèi)，繼續(xù)在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。每一濃度梯度設(shè)3個平行孔。收集各處理組癌細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次，收集1×105個細(xì)胞。按照生產(chǎn)商(深圳晶美生物技術(shù)有限公司)說明書進(jìn)行Annexin V/FITC及PI染色:加入500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μl AnnexinV/FITC混勻后，再加入PI 10 μl，漩渦混勻，室溫避光染色 15 min;加入 300 μl結(jié)合緩沖液，然后用流式細(xì)胞儀(CytomicsTMFC500，美國Beckman Coulter公司)取10，000個細(xì)胞分析癌細(xì)胞凋亡及存活情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，統(tǒng)計數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(M ±SD)表示。組間比較用獨(dú)立樣本的t檢驗(independent sample t-test)和單因素方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同藥物組對2種直結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用

由圖1和圖2可以得出，4種不同濃度的恩度單藥對直結(jié)腸癌細(xì)胞株 Caco-2的抑制率分別為:21.0%，28.5%，24.8%，27.4%;對 HT-29 細(xì)胞的抑制率分別為:10.2%，14.1%，11.3%，16.7%;結(jié)果均沒有顯示出單藥恩度對癌細(xì)胞明顯的增殖抑制作用(P＞0.05)。而4種不同濃度的恩度聯(lián)合5-Fu(100 μg/ml)藥物組對Caco-2細(xì)胞的抑制率分別為:39.5%，48.5%，58.7%，65.3%;對 HT-29 細(xì)胞的抑制率分別為:26.5%，31.9%，44.4%，53.8%。而恩度聯(lián)合奧沙利鉑(45 μg/ml))對 Caco-2細(xì)胞的抑制率分別為:38.0%，40.5%，44.7%，56.6%;對 HT-29 細(xì)胞的抑制率分別為:30.1%，31.1%，38.4%，42.6%。分析發(fā)現(xiàn)與單藥恩度相比，恩度聯(lián)合1種化療藥物對癌細(xì)胞的生長抑制率明顯升高(P＜0.05)，且可觀察到協(xié)同抑制作用。4種不同濃度的恩度聯(lián)合2種化療藥物(5-Fu和奧沙利鉑)對 Caco-2細(xì)胞的抑制率分別為:51.3%，57.8%，73.8%，83.2%，對 HT-29 細(xì)胞的抑制率分別為:41.8%，47.2%，58.1%，67.7%。與恩度聯(lián)合1種化療藥物對比，聯(lián)合2種化療藥物后恩度表現(xiàn)出更加顯著的生長抑制作用(P＜0.01)。聯(lián)合1種或2種化療藥物的恩度對癌細(xì)胞的生長抑制作用呈現(xiàn)出濃度依賴性，不同濃度存在統(tǒng)計學(xué)的差異(P＜0.05)。

圖1 不同濃度的恩度聯(lián)合化療對直結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2的生長抑制作用

圖2 不同濃度的恩度聯(lián)合化療對直結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29的生長抑制作用

2.2 不同藥物組對2種直結(jié)腸癌細(xì)胞早期凋亡的影響

由圖3和圖4可見，4種不同濃度的恩度單藥對直結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2早期凋亡率的影響分別為:17.3%，15.2%，19.3%，17.4%;對 HT-29 細(xì)胞早期凋亡率的影響分別為:6.5%，7.5%，5.7%，8.7%。結(jié)果提示單藥恩度并不能促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡(P＞0.05)。而4種不同濃度的恩度聯(lián)合5-Fu(100 μg/ml)藥物組對Caco-2細(xì)胞早期凋亡率的影響分別為:31.2%，45.1%，51.8%，62.0%;對 HT-29 細(xì)胞早期凋亡率的影響分別為:19.6%，25.7%，35.5%，48.3%。而恩度聯(lián)合奧沙利鉑(45 μg/ml))對Caco-2細(xì)胞早期凋亡率的影響分別為:28.2%，37.7%，39.5%，49.7%;對HT-29細(xì)胞早期凋亡率的影響分別為:20.5%，18.3%，26.4%，43.2%。分析發(fā)現(xiàn)與單藥恩度相比，恩度聯(lián)合1種化療藥物后其促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡能力明顯升高(P＜0.05)。4種不同濃度的恩度聯(lián)合2種化療藥物(5-Fu和奧沙利鉑)對Caco-2細(xì)胞早期凋亡率的影響分別為:45.3%，55.2%，75.8%，87.3%;對HT-29細(xì)胞早期凋亡率的影響分別為:29.3%，47.6%，59.2%，70.6%。與恩度聯(lián)合1種化療藥物對比，聯(lián)合2種化療藥物后恩度表現(xiàn)出更加顯著的促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的能力(P＜0.01)。流式細(xì)胞儀結(jié)果與MTT檢測出細(xì)胞生長抑制率的結(jié)果是一致的，同時也提示恩度與5-Fu和OXP可以表現(xiàn)出更好的協(xié)同抑制作用。

2.3 2種不同Stat6表型的直結(jié)腸癌細(xì)胞對不同藥物組存在增殖抑制和凋亡增加的差異

我們以前的研究發(fā)現(xiàn)Stat6high表型的HT-29細(xì)胞顯示出比Stat6null表型Caco-2細(xì)胞更強(qiáng)的自然抗凋亡能力和對抗化療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力［3］。將圖1和圖3與圖2和圖4對比，我們不難發(fā)現(xiàn)Caco-2細(xì)胞對恩度聯(lián)合化療藥物(1種或2種)的細(xì)胞生長抑制率和早期凋亡率均高于HT-29細(xì)胞(P＜0.05)，其中恩度聯(lián)合2種化療藥物的作用最顯著(P＜0.001)。

圖3 不同濃度的恩度聯(lián)合化療對直結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2早期凋亡的影響

圖4 不同濃度的恩度聯(lián)合化療對直結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29早期凋亡的影響

3 討論

晚期直結(jié)腸癌患者的治療是以化療為主的多種手段相結(jié)合的綜合治療。FOLFOX4方案(奧沙利鉑+CF+5-Fu)是目前國際上公認(rèn)的晚期直結(jié)腸癌的標(biāo)準(zhǔn)化療方案，但其有效率僅在30%左右。近年來，隨著各種分子靶向治療藥物的不斷推出，分子靶向藥物治療成為晚期結(jié)直腸癌研究的新熱點(diǎn)。國內(nèi)臨床研究者發(fā)現(xiàn)恩度與部分化療藥物之間存在一定的協(xié)同作用［6］。萬德森等［7］通過臨床試驗發(fā)現(xiàn)恩度聯(lián)合氟尿嘧啶具有協(xié)同作用。本研究通過腫瘤基礎(chǔ)試驗(即細(xì)胞水平的研究)發(fā)現(xiàn)不同濃度的恩度聯(lián)合化療藥物(奧沙利鉑和/或5-Fu)顯示出對直結(jié)腸癌細(xì)胞較強(qiáng)的抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用，特別是聯(lián)合2種化療藥物，再次證實了恩度與化療藥物之間存在協(xié)同作用。

我們前期的研究發(fā)現(xiàn)在人類結(jié)直腸癌細(xì)胞中存在不同的Stat6活化表型［2］，而這一現(xiàn)象同樣存在于多種惡性腫瘤細(xì)胞中(如:霍奇金淋巴瘤和縱隔B細(xì)胞淋巴瘤)。國外研究者對后兩種細(xì)胞株研究證實，有功能的Stat6細(xì)胞可能由于逃避了免疫監(jiān)視而有利于腫瘤生長［8，9］。我們的研究也觀察到了 Stat6high表型的乳腺癌細(xì)胞株ZR-75-1和直結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29和SW480都具有較高的自然抗凋亡能力和對化療藥物的低敏感性，而Stat6null表型的直結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2和Lovo則表現(xiàn)出高早期凋亡率和對化療藥物(5-Fu和奧沙利鉑)高敏感的特性［3，10］。這表明Stat6信號傳遞通路在調(diào)節(jié)多種癌細(xì)胞的增殖和凋亡方面起著重要的作用。本研究在2種化療藥物的基礎(chǔ)上加入分子靶向藥物--恩度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Stat6high表型的直結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29相比，Stat6null表型的Caco-2細(xì)胞表現(xiàn)出更高的細(xì)胞生長抑制率和早期凋亡率。這暗示Stat6null表型或Stat6基因缺失的癌細(xì)胞不僅具有較高的自然凋亡率和對化療藥物的敏感性，而且具有對恩度聯(lián)合化療藥物更強(qiáng)的敏感性。

綜上所述，本研究從細(xì)胞水平證實了分子靶向藥物恩度聯(lián)合化療藥物對直結(jié)腸癌細(xì)胞較強(qiáng)的抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用。因此，恩度聯(lián)合FOLFOX4方案一線化療方案治療晚期直結(jié)腸癌患者有較好的療效，值得臨床上推廣。同時本研究也發(fā)現(xiàn)Stat6null表型的直結(jié)腸癌細(xì)胞表現(xiàn)出對恩度聯(lián)合化療藥物更強(qiáng)的敏感性，暗示著不同Stat6活化狀態(tài)可能成為判斷腫瘤生物學(xué)特性及臨床化療和分子靶向治療療效評價的新指標(biāo)之一。

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