饒玉春，楊窯龍，李曉靜，馬伯軍，曾大力

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004;2.中國水稻研究所 水稻生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310006)

20 世紀(jì)以來，隨著工農(nóng)業(yè)、采礦、冶煉和制造等產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，農(nóng)用化學(xué)品的大量使用及城市污水的排放，植物受銅毒害的報(bào)道和研究逐漸增多［1-3］.銅是水稻生長必須的微量元素，其對(duì)水稻的影響間接且較為復(fù)雜［4］.過量的銅會(huì)導(dǎo)致水稻的銅毒害，阻礙水稻生長［5-6］，甚至影響水稻產(chǎn)量［7-8］.另外，銅在水稻體內(nèi)大量累積，通過食物鏈傳遞，進(jìn)而會(huì)威脅人類的健康［9］.

銅傷害植物首先是對(duì)根系，傷害最嚴(yán)重的也是根系［10-11］.銅對(duì)水稻幼苗根的生長有顯著的抑制作用，當(dāng)銅質(zhì)量濃度為50 mg/L 時(shí)，水稻根生長的抑制率達(dá)54%;銅質(zhì)量濃度為600 mg/L 時(shí)，抑制率高達(dá)99%，根的長度與銅濃度呈顯著的負(fù)相關(guān)［12］.水稻受銅毒害后通常表現(xiàn)為葉子細(xì)弱，葉片失綠發(fā)黃或紫紅乃至枯萎，返青延遲，心葉逐漸扭曲，植株瘦小，分蘗明顯減少，抽穗和成熟期延遲，且隨著污染程度加重，毒害癥狀相應(yīng)加重［13］.銅毒害主要是通過影響其他營養(yǎng)元素的吸收造成的.徐加寬等［14］研究發(fā)現(xiàn)，在土壤銅脅迫條件下，水稻吸磷能力明顯下降，影響植株的光合作用;邵登輝等［15］發(fā)現(xiàn)銅脅迫能顯著影響水稻對(duì)氮的吸收;Hiroki 等［16］在煙草細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，銅能使質(zhì)膜鈣通道的鈣通量增大，從而增加細(xì)胞溶質(zhì)中的游離鈣.另外，銅脅迫對(duì)水稻光合作用、體內(nèi)激素含量、細(xì)胞結(jié)構(gòu)及質(zhì)膜透性等均有影響［17］.

目前，從分子和基因水平研究植物抗重金屬污染已引起國內(nèi)外學(xué)者的高度重視［18］，但在水稻上分離出來的耐銅脅迫基因或主效數(shù)量性狀基因座(QTL)少有報(bào)道.本研究嘗試應(yīng)用一對(duì)典型的秈粳交(春江06/臺(tái)中本地1 號(hào))F1 經(jīng)花藥培養(yǎng)產(chǎn)生的雙單倍體(DH)群體及其構(gòu)建的分子連鎖圖譜，系統(tǒng)考察了該DH 群體及其雙親耐銅脅迫的情況，進(jìn)行了QTL 分析，并計(jì)算了QTL 對(duì)水稻耐銅性的貢獻(xiàn)率和加性效應(yīng)，同時(shí)還進(jìn)行了復(fù)合QTL 模型分析，以探討水稻耐銅脅迫的遺傳基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 遺傳群體的構(gòu)建

本研究利用秈稻品種臺(tái)中本地1 號(hào)(TN1)和粳稻品種春江06(CJ06)為親本，對(duì)F1 代進(jìn)行花藥離體培養(yǎng)，再經(jīng)自然加倍或秋水仙素處理，共獲得純合二倍體(DH系)120個(gè)株系，組成DH 群體.

1.2 銅脅迫濃度的確定

為確定合適銅脅迫處理的濃度，對(duì)DH 群體親本CJ06 和TN1 進(jìn)行了濃度梯度處理，設(shè)0，50，100，200，400，800，1 600 μmol/L 共7 個(gè)濃度的CuSO4溶液做梯度處理，每個(gè)處理3 次重復(fù).考察雙親在各性狀上的差異程度，選取合適的濃度對(duì)DH 群體進(jìn)行處理，用滅菌水作對(duì)照.

1.3 DH 群體耐銅脅迫的考察

種子萌發(fā)參照Tomar 等［19］的方法.取各株系的水稻種子500 粒，經(jīng)0.50%次氯酸鈉表面消毒20 min，再用去離子水沖洗數(shù)次，28 ℃暗中浸種催芽48 h，挑選露白一致的種子播于墊有2 層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)，共6 皿，培養(yǎng)皿直徑約9 cm，其中3 皿用CuSO4溶液培養(yǎng)，另3 皿滅菌水培養(yǎng).第l 天加入8 mL CuSO4溶液或滅菌水，每隔24 h換一次，連續(xù)4 d 后結(jié)束.以芽長超過1/2 種子長為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，以根長超過1/2 種子長為發(fā)根標(biāo)準(zhǔn)，記錄發(fā)芽數(shù)、發(fā)根數(shù)，計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)根率;隨機(jī)取20 粒種子測定根長、芽長;并對(duì)每皿的總根和芽稱質(zhì)量，以CuSO4溶液條件下對(duì)滅菌水條件下的百分率表示耐抑制程度.

1.4 連鎖圖譜的構(gòu)建和QTL 定位

利用微衛(wèi)星DNA(SSR)和序列標(biāo)志位點(diǎn)(STS)標(biāo)記，構(gòu)建了該DH 群體的高密度分子標(biāo)記連鎖圖譜，從中選取178 個(gè)均勻分布在12 條染色體上的標(biāo)記構(gòu)建連鎖圖譜，該連鎖圖譜總共覆蓋1 674.80 cM，平均圖距為9.44 cM，它們均適合QTL 區(qū) 間 作 圖［20-21］.采 用 作 圖 分 析 軟 件Mapmaker/Exp3.0b，用QTL 分析軟件mapmaker/QTL1.1B 對(duì)控制水稻種子萌發(fā)時(shí)期的相關(guān)性狀進(jìn)行QTL 分析.以檢出限(LOD)為2.50 作為閾值判斷QTL 的存在與否，若標(biāo)記區(qū)間檢出限＞2.50，則認(rèn)為該區(qū)間檢出限最高處所對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)為一個(gè)QTL.同時(shí)，計(jì)算出每個(gè)QTL 對(duì)各性狀表型方差的貢獻(xiàn)率和加性效應(yīng)，QTL 的命名原則遵循McCouch 等［22-23］的方法.

2 結(jié)果與分析

2.1 銅脅迫濃度的確定

本實(shí)驗(yàn)采用0，50，100，200，400，800，1 600 μmol/L 共7 個(gè)濃度的CuSO4溶液做梯度處理，對(duì)DH 群體雙親CJ06 和TN1 進(jìn)行脅迫處理，并通過統(tǒng)計(jì)方法方差分析.結(jié)果顯示:雙親在100 μmol/L CuSO4溶液的處理下差異顯著(見表1)，此時(shí)TN1 的發(fā)芽率和發(fā)根率都在97%以上，幾乎不受銅脅迫的影響;而CJ06 在該濃度下的發(fā)芽率為83%，發(fā)根率僅為61%，受脅迫的表現(xiàn)明顯;同時(shí)，雙親的平均芽長、平均根長、芽質(zhì)量和根質(zhì)量差異度很明顯.當(dāng)CuSO4溶液濃度超過200 μmol/L 以后，雙親各性狀受脅迫的影響都很大，銅濃度越高，受脅迫的表型越明顯，但雙親之間的差異難以區(qū)分.

表1 不同濃度銅處理下雙親萌發(fā)期的性狀表現(xiàn)

表2 銅脅迫下水稻萌發(fā)期相關(guān)性狀在親本間的顯著性檢測及在DH 群體中的表現(xiàn)

2.2 雙親和群體在各性狀上的表現(xiàn)

用100 μmol/L CuSO4溶液處理DH 群體中的后代各株系，并考察了萌發(fā)期相關(guān)性狀的數(shù)據(jù)，同時(shí)用滅菌水處理作對(duì)照.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，親本CJ06在發(fā)芽率、發(fā)根率、平均芽長、根質(zhì)量和芽質(zhì)量等性狀上對(duì)銅脅迫比TN1 敏感(見表2)，尤其發(fā)根率和平均芽長最為明顯.且120 個(gè)DH 株系對(duì)銅脅迫的耐抑制表現(xiàn)為連續(xù)正態(tài)分布，且有一定數(shù)量的超親類型存在，符合QTL 區(qū)間作圖的要求.

2.3 性狀間的相關(guān)性分析

表3 是各性狀的相關(guān)性分析結(jié)果，表明:水稻發(fā)芽率與發(fā)根率、根質(zhì)量與芽質(zhì)量之間均呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)，尤其是水稻種子的發(fā)芽率與發(fā)根率之間，在處理前后其相關(guān)系數(shù)都達(dá)到了0.90，而根質(zhì)量與芽質(zhì)量的相關(guān)系數(shù)也達(dá)到了0.50 附近.由此可以說明，水稻發(fā)芽期間，根與芽之間有著密切的相關(guān)性.在這些性狀中，根長與其他的性狀并不存在相關(guān)性，說明根長與其他性狀關(guān)系并不密切.同時(shí)，相關(guān)性分析也表明:未用CuSO4溶液處理的水稻種子，其平均芽長與平均根長并無顯著相關(guān)性;而用100 μmol/L CuSO4溶液處理后，其平均芽長與平均根長呈現(xiàn)顯著正相關(guān).這可能是由于用100 μmol/L CuSO4溶液處理對(duì)水稻種子的平均芽長與平均根長影響較大.

2.4 QTL 定位

利用該DH 群體對(duì)水稻萌發(fā)期相關(guān)性狀進(jìn)行了QTL 分析，有11 個(gè)性狀檢測到了相關(guān)的QTL(見圖1 和表4)，共有30 個(gè)QTLs，它們分布于除8，11 和12 染色體外的其他9 條染色體上.其中，用滅菌水處理種子后檢測到萌發(fā)期相關(guān)性狀的QTL 共22 個(gè)，用100 μmol/L CuSO4溶液處理后檢測到萌發(fā)期相關(guān)性狀的QTL 共6 個(gè)，而抑制程度共檢測到1 個(gè)QTL.

表3 DH 群體中水稻萌發(fā)期各性狀的相關(guān)性分析

圖1 CJ06/TN1 DH 群體水稻萌發(fā)期相關(guān)性狀的QTL 定位圖譜

表4 DH 群體中水稻萌發(fā)期相關(guān)性狀的QTL 定位

在用滅菌水處理種子后檢測到的22 個(gè)QTLs中，與發(fā)芽率、發(fā)根率、根長、芽長、根質(zhì)量和芽質(zhì)量相關(guān)的QTL 分別有3，3，1，4，3 和8 個(gè)，它們分別位于除4，11 和12 染色體之外的所有染色體上，其檢出限介于2.52～4.30，可以解釋性狀變異的8.00%～15.70%.在這些QTL 中，與發(fā)芽率相關(guān)的QTL 有3 個(gè)，位于1，2 和3 染色體上，與發(fā)根率檢測到的QTL 區(qū)間重合，說明水稻種子發(fā)芽與發(fā)根是緊密相關(guān)的，受同一類QTL 控制.在7 染色體上檢測到1 個(gè)與根長相關(guān)的QTL.而與芽長相關(guān)的QTL 有4 個(gè)，分別位于1，3，7 和10 染色體上，其中有3 個(gè)增效等位基因來自于TN1，1 個(gè)來自于CJ06，這可以間接解釋TN1 的芽長比CJ06長的原因.另外，檢測到3 個(gè)與根質(zhì)量有關(guān)的QTL，其中在5 染色體上有一個(gè)檢出限達(dá)到了4.30，可解釋性狀變異的15.70%.檢測到與芽質(zhì)量有關(guān)的QTL 有8 個(gè)，其檢出限介于2.74～4.24之間，可解釋性狀變異的8.00%～15.20%，其QTL 大部分都和發(fā)芽率、發(fā)根率、根長、芽長、根質(zhì)量的QTL 區(qū)間重合，這也充分說明水稻萌發(fā)期各類性狀的調(diào)控都存在著相互聯(lián)系.

用100 μmol/L CuSO4溶液處理種子后檢測到6 個(gè)萌發(fā)期相關(guān)性狀的QTL，分布在1，2 和7染色體上，其中發(fā)芽率與發(fā)根率具有重合的QTL區(qū)間，進(jìn)一步說明了發(fā)芽率與發(fā)根率存在著密切的關(guān)系.但沒有檢測到根長與根質(zhì)量的相關(guān)QTL.而芽長與芽質(zhì)量相關(guān)性狀，不管是經(jīng)過100 μmol/L CuSO4溶液處理后，還是沒有經(jīng)過CuSO4溶液處理，在2 染色體上的RM526-RM525 區(qū)間與7 染色體上的RM505-RM234 區(qū)間都檢測到了相關(guān)QTL，說明2 個(gè)QTL 區(qū)間對(duì)芽長與芽質(zhì)量的調(diào)控是密切相關(guān)的，且對(duì)銅脅迫有一定的耐性.

對(duì)水稻萌發(fā)期100 μmol/L CuSO4溶液處理后各性狀的抑制程度進(jìn)行QTL 分析，發(fā)根率、根長、芽長、根質(zhì)量和芽質(zhì)量均沒有檢測到相關(guān)的QTL，只有發(fā)芽率的抑制程度在3 染色體上RM282-RM6266 區(qū)間檢測到1 個(gè)QTL，該增效基因來自于TN1，可解釋表型變異的12.10%.

3 討論

目前，對(duì)于水稻萌發(fā)期耐銅脅迫的研究相對(duì)較少，也沒有明確的耐銅脅迫基因的相關(guān)報(bào)道.應(yīng)用銅脅迫實(shí)驗(yàn)進(jìn)行群體的耐銅性遺傳研究，選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)方式和合適的銅脅迫濃度是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵［24］.本實(shí)驗(yàn)利用不同濃度的硫酸銅溶液對(duì)DH 群體的雙親進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)在100 μmol/L CuSO4溶液處理下，雙親萌發(fā)期的各種性狀差異較為顯著;之后，用該濃度銅脅迫處理整個(gè)群體，同時(shí)用滅菌水處理作為對(duì)照，進(jìn)行QTL 作圖;最后，將100 μmol/L CuSO4溶液處理下各種性狀的值和用滅菌水處理下對(duì)應(yīng)性狀的值的比值作為一種抑制程度的指標(biāo)進(jìn)行QTL 分析.在檢測到的QTLs 中，大部分是在滅菌水處理下檢測到的，用100 μmol/L CuSO4溶液處理后共檢測到萌發(fā)期相關(guān)性狀的6 個(gè)QTLs，而抑制程度共檢測到1 個(gè)QTL，這可能是由于經(jīng)過銅處理后普遍抑制了控制各性狀的QTLs 的作用，且其抑制程度相當(dāng)，消除了個(gè)別QTL 的主效作用.其中在1 染色體上RM104-RM1067 區(qū)間和2 染色體RM526-RM525區(qū)間檢測到了芽質(zhì)量的QTL 與滅菌水處理下檢測到的芽質(zhì)量QTL 區(qū)間一致，說明在這兩區(qū)間內(nèi)存在著控制芽質(zhì)量的主效QTL，不受CuSO4溶液處理的影響，證明這兩位點(diǎn)對(duì)銅脅迫有很好的耐性.同樣，發(fā)芽率和發(fā)根率2 個(gè)性狀在CuSO4溶液處理前后都能在2 染色體的RM145-RM521 區(qū)間上檢測到相應(yīng)的QTL，證明這個(gè)區(qū)間內(nèi)也存在著對(duì)銅脅迫有很好耐性的位點(diǎn).

對(duì)比其他學(xué)者的研究結(jié)果，有些耐銅脅迫的區(qū)間與本實(shí)驗(yàn)檢測到的區(qū)間有重疊.姚盟成等［25］利用栽培稻優(yōu)良品種“特青”與普通野生稻“元江普野”構(gòu)建的DH 群體139 個(gè)家系構(gòu)建連鎖圖譜，用硫酸銅(150 mg/L)脅迫處理2 葉期的水稻苗，在水稻2 染色體RM318 標(biāo)記處檢測到了耐銅脅迫的QTL，與本實(shí)驗(yàn)檢測到的耐銅脅迫的區(qū)間類似.同時(shí)，藏金萍［26］以伊朗粳稻品種Binam 為供體，以秈稻品種特青為輪回親本，構(gòu)建了BC2F8定位群體，并在水稻3 染色體上定位到了耐鹽的QTL(QRkc3)，該區(qū)間在本實(shí)驗(yàn)檢測到的耐銅脅迫的區(qū)間附近，說明在水稻2 染色體RM526-RM525 區(qū)間周圍存在一個(gè)主效的位點(diǎn)，對(duì)高濃度的金屬脅迫有一定的耐性，由于所用的親本品種和考察的性狀不一致而導(dǎo)致了區(qū)間略有偏移.另外，在3 染色體上檢測到關(guān)于發(fā)芽率抑制程度的QTL 區(qū)間RM282-RM6266 以前未曾見報(bào)到;CuSO4溶液處理下，在7 染色體上檢測到關(guān)于芽長的QTL 區(qū)間RM505-RM234 與前人的研究區(qū)間也不重疊.

整體上看，CuSO4溶液處理后檢測到一些耐銅的QTL，但QTL 與環(huán)境互作是影響數(shù)量性狀表達(dá)的重要因素［27］，要從遺傳上改良水稻品種的耐銅性并非易事，通過常規(guī)有性雜交技術(shù)難于將這些分散的有利基因集中起來.下一步我們將通過分子標(biāo)記輔助選育技術(shù)，構(gòu)建關(guān)于這幾個(gè)耐銅脅迫位點(diǎn)的單片段置換系，以期為選育抗性品種提供耐銅脅迫的基因.

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