左乙拉西坦片在健康人體內(nèi)的生物等效性研究

何小愛，劉智，朱剛直（1.海口市人民醫(yī)院暨中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院，?？?7008；.湖南泰格湘雅藥物研究有限公司，長沙 41000）

左乙拉西坦（Levetiracetam）為吡拉西坦的類似物，是一種新型抗癲癇藥，用于成人及4歲以上兒童癲癇患者部分性發(fā)作的添加治療。與傳統(tǒng)的抗癲癇藥相比，左乙拉西坦作為添加治療對于兒童各型癲癇均有療效，尤其對于復(fù)雜局限性發(fā)作、肌陣攣發(fā)作等具有較好的治療效果，且不良反應(yīng)輕，是一種安全性好、療效佳的抗癲癇新藥；對于成人耐藥性癲癇部分性發(fā)作治療亦有效，且不良反應(yīng)輕，對耐藥性癲癇患者是一種有益的選擇。本試驗(yàn)對2個不同廠家生產(chǎn)的左乙拉西坦片進(jìn)行人體相對生物利用度測定，從而作出生物等效性評價。

1 材料

1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀，包括在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、四元泵、柱溫箱、紫外檢測器及Chemstation化學(xué)工作站（美國安捷倫公司）；AB135-S十萬分之一天平（瑞士梅特勒托利多公司）；TGL16 M型冷凍離心機(jī)（長沙英泰儀器有限公司）；AHL-2001-P型實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)（重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司）。

1.2 藥品與試劑

受試制劑：左乙拉西坦片（天津泰普藥品科技發(fā)展有限公司，規(guī)格：每片250 mg，批號：20110304）；參比制劑：左乙拉西坦片（UCB Pharma S.A，規(guī)格：每片250 mg，批號：31745）；左乙拉西坦對照品（天津藥物研究院藥業(yè)有限責(zé)任公司，含量：99.87%，批號：101201）；內(nèi)標(biāo)：戊巴比妥鈉對照品（北京化學(xué)試劑公司，批號：061206）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate LP-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；保護(hù)柱：Ultimate LP-C18（10 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.6%磷酸水溶液-乙腈[梯度洗脫程序：0～8.45 min，84∶16（V/V）]；8.45～8.5 min，由84∶16（V/V）均勻變換到10∶90（V/V）；8.5～9.45 min，10∶90（V/V）；9.45～9.5 min，由10∶90（V/V）均勻變換到84∶16（V/V）；流速：1 ml/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20 μl；檢測波長：210 nm。

2.2 溶液的配制

2.2.1 左乙拉西坦貯備液：準(zhǔn)確稱取左乙拉西坦對照品10 mg，置于10 ml量瓶中，以少量水溶解后，加水至刻度線，搖勻，即得含左乙拉西坦?jié)舛葹? g/L的貯備液，置于4℃冰箱保存。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)密稱取戊巴比妥鈉對照品10 mg，置于10 ml量瓶中，用少量水溶解后，加水至刻度，搖勻，即得濃度為1 g/L的內(nèi)標(biāo)戊巴比妥鈉貯備液，置于4℃冰箱保存。臨用前將內(nèi)標(biāo)貯備液用水稀釋成濃度為500μg/L的內(nèi)標(biāo)戊巴比妥鈉工作溶液。

2.3 血樣預(yù)處理

精密移取200 μl血漿樣本于10 ml玻璃離心試管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液（500 μg/ml戊巴比妥鈉）50 μl，渦旋混勻30 s，加入乙酸乙酯3 ml，渦旋3 min，450 g離心力離心5 min，吸取上清液2.5 ml至另一潔凈玻璃試管中，40℃氮?dú)饬飨麓蹈桑?00 μl純水復(fù)溶，進(jìn)樣20 μl到色譜系統(tǒng)分析。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 系統(tǒng)適用性：配制含左乙拉西坦0.3125 μg/ml的血漿樣本1份，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析5次，分別記錄待測物與內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積值，并計(jì)算待測物與內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積比值，考察其精密度。結(jié)果表明，每個分析批的5次重復(fù)分析的RSD均＜10%，滿足生物樣本測試方法要求。

2.4.2 特異性：選取6份不同來源的健康受試者空白血漿，按照“2.3”項(xiàng)下操作處理（不加內(nèi)標(biāo)），進(jìn)樣分析得到空白血漿樣本色譜圖，其典型色譜圖見圖1 A；選取6份不同來源的健康受試者空白血漿，配成含左乙拉西坦質(zhì)量濃度為0.3125 μg/ml的血漿樣本，按照“2.3”項(xiàng)下操作處理，進(jìn)樣分析得到加樣血漿樣本色譜圖，其典型色譜圖見圖1 B；取健康受試者用藥物后0.5 h的血漿樣本，按照“2.3”項(xiàng)下操作處理，進(jìn)樣分析得到受試者使用藥物后的代表性血漿樣本色譜圖，其典型色譜圖見圖1 C。結(jié)果表明，左乙拉西坦和內(nèi)標(biāo)戊巴比妥鈉保留時間分別為5.4 min和10.6 min左右，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾左乙拉西坦和內(nèi)標(biāo)戊巴比妥鈉的測定。

圖1 典型色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+0.3125 μg/ml左乙拉西坦對照品溶液；C.口服左乙拉西坦片500 mg后0.5 h血漿樣品Fig 1 Typical chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+0.3125 μg/ml levetiracetam control；C.plasma sample 0.5h after a single oral dose of Levetiracetam tablets 500 mg

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低定量限：配制含左乙拉西坦40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25、0.625、0.3125 μg/ml的8個不同質(zhì)量濃度級別的系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣本，按照“2.3”項(xiàng)下操作后處理進(jìn)樣分析，記錄色譜。以左乙拉西坦和內(nèi)標(biāo)戊巴比妥鈉峰面積比值（y）作為縱坐標(biāo)、左乙拉西坦?jié)舛龋▁）為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y＝0.2498 x－0.0001（r＝0.9997），權(quán)重二次曲線（響應(yīng)值）。結(jié)果表明，左乙拉西坦血藥濃度在0.3125～40 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。最低定量限為0.3125 μg/ml。

2.4.4 絕對回收率試驗(yàn)：配制含左乙拉西坦0.625、5.0、32.0 μg/ml的血漿樣本各5份，按照“2.3”項(xiàng)下操作處理后進(jìn)樣到色譜系統(tǒng)分析，分別得到血漿樣本中左乙拉西坦的峰面積A1；另取含左乙拉西坦6.25、50.00、320.00 μg/ml的對照品溶液各20 μl，加入50 μl內(nèi)標(biāo)工作液和30 μl純水，混勻后進(jìn)樣到色譜系統(tǒng)分析，各濃度平行5份。分別得到左乙拉西坦的色譜峰面積A2。絕對回收率計(jì)算公式為3/2.5×A1/A2×100%，結(jié)果見表1。

表1 精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of precision and recovery tests

2.4.5 精密度與回收率試驗(yàn)：配制含左乙拉西坦0.625、5.0、32.0 μg/ml的血漿樣品各5份，按照“2.3”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣分析，以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算左乙拉西坦?jié)舛?。連續(xù)3 d做3批次，考察左乙拉西坦測定方法的精密度和準(zhǔn)確度。精密度和方法回收率結(jié)果見表1。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)：配制含左乙拉西坦0.625、5.0、32.0μg/ml的血漿樣本，平行各4份。1份配制好后按“2.3”項(xiàng)下方法操作后，立即進(jìn)樣分析；1份血樣室溫放置4 h后提取操作；1份冷凍保存60 d后取出，解凍后提取操作；1份反復(fù)凍融3次后提取操作。結(jié)果顯示，所有穩(wěn)定性考察試驗(yàn)測定值與添加值的相對偏差（RE）均＜15%，說明分析測試過程中的樣本較為穩(wěn)定。

2.5 受試者選擇

選擇20名健康男性志愿者，年齡為（22.2±2.1）歲，體質(zhì)量為（65.4±6.1）kg，身高為（173.1±4.3）cm，無煙、酒嗜好。試驗(yàn)前經(jīng)詢問病史、體格檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查均未發(fā)現(xiàn)異常；受試者無藥物過敏史和藥物依賴史，無精神病史以及其他慢性病史；2周內(nèi)未使用任何藥物；試驗(yàn)期間統(tǒng)一清淡飲食；簽署知情同意書。試驗(yàn)方案經(jīng)中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

2.6 給藥方法

采用隨機(jī)、開放、兩制劑、兩周期、交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將20名健康男性受試者隨機(jī)分為2組，每組10人。于試驗(yàn)前一日20：00開始禁食，禁食12 h后，試驗(yàn)當(dāng)日8：00空腹給藥，每名受試者用200 ml溫水送服左乙拉西坦片500 mg，服藥2 h后進(jìn)水，4 h后統(tǒng)一進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)餐。洗脫期7 d，交叉重復(fù)上述試驗(yàn)。

2.7 血樣采集

分別于給藥前（0 h）及給藥后0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、9.0、12.0、24.0、36.0 h時抽取肘靜脈血5 ml，于3000 r/min離心5 min，分離血漿，－20℃保存待測。

2.8 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

使用WinNonlin 6.0軟件，采用非房室參數(shù)求算方法（NCA模塊），對左乙拉西坦的人體藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行求算。采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 相對生物利用度試驗(yàn)結(jié)果

20名健康受試者隨機(jī)交叉單劑量口服左乙拉西坦受試制劑或參比制劑500 mg后，其平均藥-時曲線見圖2；主要藥動學(xué)參數(shù)見表2。

圖2 健康志愿者單劑量口服2種左乙拉西坦片500mg后的平均藥-時曲線（n＝20）Fig 2 Mean plasma concentration-time curves of levetiracetam in healthy volunteers after a single oral dose of 500mg Levetiracetam tablet（n＝20）

3.2 生物等效性評價

受試制劑和參比制劑中左乙拉西坦的AUC0-36h、AUC0-∞及cmax經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后，進(jìn)行方差分析，方差分析及Mann-WhitneyU檢驗(yàn)均以P＜0.05為組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，AUC0-36h、AUC0-∞和cmax在不同周期間及不同制劑間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，雙單側(cè)t檢驗(yàn)結(jié)果表明AUC0-t、cmax值的統(tǒng)計(jì)參數(shù)th和tl均＞單側(cè)t（0.05，18）（1.734）。受試制劑和參比制劑tmax值經(jīng)Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)，結(jié)果表明tmax在不同制劑間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。受試制劑對參比制劑的相對生物利用度（F）為（102.0±7.8）%。雙單側(cè)t檢驗(yàn)計(jì)算所得的受試制劑AUC0-36h、AUC0-∞及cmax的90%可信區(qū)間分別為97.9%～104.1%、98.6%～105.0%和98.0%～116.0%，把握度（Power）均＞0.8。其中cmax落在參比制劑cmax的75%～133%的范圍內(nèi)，AUC0-36h、AUC0-∞落在參比制劑AUC的80%～125%的范圍內(nèi)。根據(jù)以上結(jié)果判定，受試制劑與參比制劑具有生物等效性。

表2 健康志愿者單劑量口服2種左乙拉西坦片500mg的主要藥動學(xué)參數(shù)（n＝20）Tab 2 Main pharmacokinetics parameters of levetiracetam in healthy volunteers after single oral dose of 500mg Levetiracetam tablet（n＝20）

4 討論

本研究分析測試方法靈敏度和準(zhǔn)確度高、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，經(jīng)方法學(xué)考察確證其相對回收率和日內(nèi)、日間精密度均符合生物樣品測定的要求，適用于血漿中左乙拉西坦質(zhì)量濃度測定及其藥動學(xué)研究。在本文中，2種左乙拉西坦片的主要藥動學(xué)參數(shù)不存在顯著性差異，且與文獻(xiàn)報道基本一致[1-5]，表明2種制劑在體內(nèi)的藥動學(xué)過程基本一致。受試制劑的相對生物利用度為（102.0±7.8）%，2種制劑具有生物等效性。

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