★ 成差群 魏燕華（廣州市荔灣區(qū)芳村中醫(yī)醫(yī)院 廣州510360）

追風(fēng)活血膏由馬錢子、川烏、草烏、當(dāng)歸、乳香、沒藥、骨碎補(bǔ)等17味藥材組成，具有追風(fēng)祛寒、活血散瘀、消腫止痛的功效，用于治療腰腿痛，關(guān)節(jié)痛，筋骨麻木等。本文在原標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，增加了馬錢子、川烏、草烏、當(dāng)歸、乳香、沒藥的薄層鑒別，采用HPLC法對制劑中君藥有效成分士的寧和馬錢子堿進(jìn)行含量測定，建立追風(fēng)活血膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），紫外檢測器；電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；DS31200 超聲波清洗器（天津市東康科技有限公司）；PHS-2C 型酸度計（上海偉業(yè)儀器廠）。硅膠G板，規(guī)格為10×10 cm，厚度0.2 mm（青島洋化工廠）。

士的寧對照品（批號：110706-200306）；馬錢子堿對照品（批號：110706-200505）；烏頭堿對照品（批號：16720-200410）；當(dāng)歸對照藥材（批號：927-9907）；乳香對照藥材（批號：0970-9402）；沒藥對照藥材（批號：120967-200603），追風(fēng)活血膏樣品（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院自制，批號：100801、100903、101101、101201、101205），乙腈為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 追風(fēng)活血膏的制備方法

取追風(fēng)活血膏處方量藥材，除乳香、沒藥、海龍碎成細(xì)粉外，其余馬錢子、川烏、草烏、當(dāng)歸、牛膝等藥材酌予碎斷，70%乙醇回流提取2次，第1次加10倍量，提取2 小時，第1 次加8 倍量，提取1 小時，合并濾液，回收乙醇，濃縮成稠膏。另取空白膏藥基質(zhì)12 000 g用文火熔化，待溫度降至70℃后，加入上述稠膏及乳香、沒藥、海龍細(xì)粉，攪勻，分?jǐn)傆诓蓟蚣埳?，即得?/p>

3 薄層色譜鑒別

3.1 馬錢子薄層色譜鑒別

取本品30 g，剪碎，加濃氨試液2.0 mL，無水乙醇100 mL，超聲提取30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加1%鹽酸溶液50 mL使溶解，濾過，濾液加氨試液調(diào)pH 至10.0，再加氯仿萃取3 次，每次50 mL，合并氯仿液，水浴蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取士的寧對照品、馬錢子堿對照品，加三氯甲烷制成每1 mL 各含2 mg 的混合溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（附錄ⅥB）試驗，吸取上述兩種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-丙酮-乙醇-濃氨試液（4：5：0.6：0.4）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點[1]。

圖1 馬錢子薄層色圖譜

圖2 沒藥薄層色譜圖

3.2 沒藥薄層色譜鑒別

取本品60 g，剪碎，照揮發(fā)油測定法（附錄XD乙法）加環(huán)己烷2 mL，緩緩加熱至沸。并保持微沸約2.5 小時，放置后，取環(huán)己烷溶液作為供試品溶液。另取沒藥對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（附錄ⅥB）試驗，吸取上述供試品溶液、對照藥材溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙醚（4：1）為展開劑，展開，取出，晾干，立即噴以l0%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中。在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點[2]。

3.3 乳香薄層色譜鑒別

取本品60 g，剪碎，加無水乙醇100 mL，加熱回流提取30分鐘，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取乳香對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（附錄ⅥB）試驗，吸取上述供試品溶液、對照藥材溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（30℃-60℃）-乙酸乙酯（85：5）為展開劑，展開，取出，晾干，立即噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點[3]。

圖3 乳香薄層色圖譜

圖4 當(dāng)歸薄層色圖譜

3.4 當(dāng)歸薄層色譜鑒別

取本品100 g，剪碎，加甲醇250 mL，超聲提取30 分鐘，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取當(dāng)歸對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（附錄ⅥB）試驗，吸取上述供試品溶液、對照藥材溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以正己烷－乙酸乙酯（9：1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下觀察。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點[4]。

3.5 川烏、草烏薄層色譜鑒別

取本品60 g，剪碎，加濃氨試液2.0 mL，無水乙醇200 mL，超聲提取30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加1%鹽酸溶液50 mL使溶解，濾過，濾液加氨試液調(diào)pH 至10.0，再加乙醚萃取3 次，每次50 mL，合并乙醚液，水浴蒸干，殘渣加二氯甲烷1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取烏頭堿對照品，加二氯甲烷制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（附錄ⅥB）試驗，吸取上述兩種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇（6.4：3.6：1）為展開劑，置氨蒸氣飽和20分鐘的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點[5]。

圖5 川烏、草烏薄層色譜圖

4 士的寧和馬錢子堿的含量測定

4.1 色譜條件

色譜柱：KROMASIL C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.01mol·L-1庚烷磺酸鈉與0.02 mol·L-1的磷酸二氫鉀等量混合溶液（用10%磷酸調(diào)節(jié)pH 值2.8）（21：79）；柱溫：30℃；檢測波長：260 nm；流速：1.0 mL∕分；理論板數(shù)：按士的寧計算，應(yīng)不低于4 000。

4.2 溶液的制備

4.2.1 供試品溶液的制備 本品除去裱背材料，剪碎，取剪碎后的膏藥30 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加濃氨試液5 mL，混勻，放置30分鐘，精密加入甲醇100 mL，密塞，稱定重量，置水浴中回流提取2小時，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，分取甲醇液，用鋪有少量無水硫酸鈉的濾紙濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得[6]。

4.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取士的寧及馬錢子對照品適量，加甲醇制成0.121 mg·mL-1士的寧和0.085 mg·mL-1馬錢子堿的混合對照品溶液。

4.2.3 陰性對照溶液制備 按處方量比例取除馬錢子外的處方藥材，制備馬錢子陰性樣品。取馬錢子陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備，得馬錢子陰性對照溶液。

4.3 專屬性試驗

分別吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照液各5 μL，按所定色譜條件進(jìn)樣并記錄色譜圖，結(jié)果顯示，陰性樣品溶液，對測定結(jié)果無干擾。色譜圖見圖6。

圖6 追風(fēng)活血膏HPLC圖

4.4 線性與線性范圍

精密量取士的寧與馬錢子堿混合對照品溶液2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0 μL，分別注入液相色譜儀中，測定色譜峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得士的寧和馬錢子堿的回歸方程分別為：Y=209.8X-55.82（r=0.9997），Y=158.3X-33.98（r=0.9999）。士的寧和馬錢子堿的線性范圍分別為0.30=2.42 μg和0.21=1.70 μg。

4.5 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，于0、2、4、6、8 小時進(jìn)樣檢測，依法測定，士的寧和馬錢子堿RSD分別為1.28%和1.96%，表明供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。

4.6 重復(fù)性試驗

取批號為101101的追風(fēng)活血膏樣品，按供試品溶液制備方法，平行操作6 份，依法測定，結(jié)果士的寧和馬錢子堿RSD 分別為0.96%和2.01%，表明該方法重復(fù)性良好。

4.7 精密度試驗

取士的寧和馬錢子堿混合對照品溶液，依法測定，連續(xù)測定6次，結(jié)果士的寧和馬錢子堿RSD分別為0.78%和0.82%，表明儀器精密度良好。

4.8 加樣回收率試驗

精密稱取批號為101101 的樣品（士的寧含量0.335 mg·g-1，馬錢子堿含量0.173 mg·g-1）適量，分別精密加入士的寧對照品溶液（2.436 mg·mL-1）2.0 mL和馬錢子堿對照品溶液（1.244 mg·mL-1）2.0 mL，按供試品溶液制備方法，平行操作6 份，依法測定，結(jié)果士的寧和馬錢子堿平均回收率分別為99.10%和98.27%，RSD分別為1.82%和1.64%。

表1 士的寧加樣回收率試驗結(jié)果

表2 馬錢子堿加樣回收率試驗結(jié)果

4.9 樣品測定結(jié)果

精密稱取5 批追風(fēng)活血膏樣品，按“4.2.1”項下方法制備供試品溶液，依法測定，結(jié)果見表3，按照處方量計算，每g 膏藥中含馬錢子原粉約25 mg，參照中國藥典2010 版一部馬錢子含士的寧應(yīng)為1.20%-2.20%，馬錢子堿不低于0.80%，折算成本品每g含士的寧應(yīng)為0.30-0.55 mg，馬錢子堿不低于0.2 mg，考慮到藥材轉(zhuǎn)移率，確定本品每g 含士的寧應(yīng)為0.24-0.44 mg，馬錢子堿不低于0.16 mg。

表3 樣品中羥甲香豆素含量測定結(jié)果（n=3）

5 討論

5.1 關(guān)于黑膏藥的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，2010 版《中國藥典》規(guī)定“膏藥應(yīng)烏黑發(fā)亮，油潤細(xì)膩，老嫩適度，攤涂均勻，無紅斑，無飛邊缺口，加溫后能粘貼于皮膚上且不移動，膏藥軟化點適宜”的外觀判斷及重量差異控制，上述質(zhì)量控制仍多以經(jīng)驗方法判斷，缺少全面反映黑膏藥質(zhì)量的客觀指標(biāo)和檢測方法。本文在此基礎(chǔ)上對方中的馬錢子、川烏、草烏、當(dāng)歸、乳香、沒藥等進(jìn)行了定性鑒別，對方中君藥進(jìn)行了HPLC 定量測定，可以更好的控制追風(fēng)活血膏的內(nèi)在質(zhì)量。

5.2 為了準(zhǔn)確測定追風(fēng)活血膏樣品中士的寧和馬錢子堿的含量，我們對制劑的供試品溶液的制備方法進(jìn)行了考察，提取方法選擇了超聲、加熱回流、浸漬的方法，提取溶劑選擇了氯仿、甲醇和乙醇，結(jié)果：氯仿作為溶劑可以將膏藥的基質(zhì)溶解，而得到粘稠的氯仿提取液，無法進(jìn)一步處理，而采用甲醇加熱回流提取的方法最佳。經(jīng)方法學(xué)驗證，該方法回收率較好，空白對照無干擾，能夠達(dá)到控制追風(fēng)活血膏質(zhì)量的目的。

5.3 在樣品加熱回流提取過程中，需要注意避免冷凝管外部的水珠流入提取的錐形瓶中，以免提取前后提取物的總重量增加。濃氨試液加入后，應(yīng)充分振搖，使?jié)獍痹囈壕鶆虻母采w在剪碎的膏藥的表面，以保證在提取過程中膏藥中的生物堿均以游離狀態(tài)存在。

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