三脈紫菀總皂苷的提取工藝研究

★ 劉愛紅 袁金斌 劉榮華 鐘國躍 鄭燕梅 任剛 (.南昌大學(xué)分析測試中心 南昌0047;.江西中醫(yī)學(xué)院現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室 南昌0004;.江西中醫(yī)學(xué)院中藥資源與民族藥研究中心 南昌0004)

三脈紫菀(Aster ageratoidesTurcz.)為菊科(Compositae)紫菀屬植物，具有清熱解毒、祛痰鎮(zhèn)咳的功效［1］。在江西民間三脈紫菀是治療咳喘病的有效單方，并在當(dāng)?shù)匾虼说妹皳Q肺草”。1971 年全國攻克老年慢性氣管炎工作會議上，三脈紫菀被定為全國18 個有效方劑之一。紫菀屬植物的化學(xué)成分主要包括黃酮類(地上部分)和皂苷類(地下部分)，此外還含有三萜、倍半萜、二萜、單萜、甾醇、脂肪酸和肽類等成分［2］。其中根部的三萜皂苷類是紫菀屬特征性成分，也是三脈紫菀祛痰作用的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一［2］。前期研究中，筆者建立了三脈紫菀總黃酮的提取工藝［3］，本研究繼續(xù)對總皂苷的提取工藝進(jìn)行了研究，以期為三脈紫菀總皂苷的進(jìn)一步化學(xué)、藥理研究打下基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-2550 型紫外分光光度計(日本Shimadzu公司)、R -210 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi 公司)、Sartorious BT 124S 型萬分之一天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、GZX -9070MBE 型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、高速中藥粉碎機(瑞安市永歷制藥機械有限公司)、KQ-300DB 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

三脈紫菀于2010 年采于江西省吉安市永新縣郊外，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)劉榮華教授鑒定為菊科紫菀屬植物三脈紫菀。齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品購自南昌市藥品檢驗所(批號:110709 -201104)。香蘭素、濃硫酸為國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，甲醇、乙醇、冰醋酸等有機溶劑均為上海振興化工一廠產(chǎn)品，蒸餾水自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 三脈紫菀總皂苷含量測定

2.1.1 藥材的處理

取三脈紫菀根除盡塵土，陰干，粉碎過40 目篩，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品11.0mg，乙醇溶解并定容至50mL，得0.22mg·mL-1的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品母液。

2.1.3 測定波長的選擇

稱取“2.1.1”項制備的藥材粉末1.5g，置于回流裝置，加入30mL75%乙醇，于70℃浸提2 小時，過濾，濾液轉(zhuǎn)移至50mL 容量瓶中，加乙醇定容至刻度，搖勻，得樣品溶液。

分別吸取0.2mL 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液于具塞試管中，揮干溶劑，準(zhǔn)確加入新配置的5%香草醛-冰醋酸0.2mL，再加入72%的濃硫酸3mL，振搖。于60℃水浴中加熱，20 分鐘后取出，流水冷卻至室溫。標(biāo)準(zhǔn)品管以未加標(biāo)準(zhǔn)品的相同試劑作空白，樣品管以未加顯色溶液的樣品溶液為空白，在400 -700nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，得紫外吸收光譜圖(見圖1)。圖上可見，標(biāo)準(zhǔn)品及樣品在536nm 處有共同的最大吸收波長，因此選擇536nm為測定波長。

圖1 三脈紫菀提取物與齊墩果酸的紫外-可見光吸收圖譜

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精確吸取上述齊墩果酸母液0.5，0.7，0.9，1.0，1.1mL，分別加入具塞試管中揮干溶劑，加入新配置的香草醛-冰乙酸溶液0.2mL，再加入72%的濃硫酸溶液3mL，振搖。在60℃水浴中加熱20 分鐘取出，流水冷卻至室溫。在536nm 處測定各試管中溶液的吸光度。以齊墩果酸的質(zhì)量(X)為橫坐標(biāo)，吸光值(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以最小二法線性回歸，得線性回歸方程:Y =1.9416X +0.1392，相關(guān)系數(shù)為r=0.9989。

2.1.5 供試品溶液的制備及測定

準(zhǔn)確稱取“2.1.1”項制備的藥材粉末5g 干燥至恒重，按正交設(shè)計的提取條件回流提取。提取液過濾后減壓濃縮，浸膏用適量乙醇溶解，過濾，濾液移至50mL 容量瓶中，加乙醇定容至刻度，搖勻即得待測樣品溶液。按“2.1.4”項的操作方法測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算總皂苷含量。

2.1.6 精密度實驗

取同一供試品溶液，在536nm 處重復(fù)測定六次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到總皂苷含量，結(jié)果表明精密度良好，RSD 為0.23%(n=6)。

2.1.7 穩(wěn)定性考察

取同一供試品溶液，分別于0，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，4，8 小時分別進(jìn)行測定，計算RSD 為2.86%(n =9)，表明總皂苷含量在8 小時內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.8 重現(xiàn)性實驗

精密稱取同一批次三脈紫菀藥材粉末5 份，按照“2.1.5”項下方法制備樣品溶液，照“2.1.4”項下的操作方法測定吸光度，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好，RSD 為1.30%(n=5)。

2.1.9 加樣回收率實驗

準(zhǔn)確稱取已知含量的三脈紫菀藥材粉末0.5g，加入齊墩果酸適量，“2.1.5”項下方法制備樣品溶液，照“2.1.4”項下的操作方法測定吸光度，計算回收率。結(jié)果表明，平均回收率為97.08%，RSD 為1.22%，說明該方法測得的結(jié)果準(zhǔn)確。

2.2 提取工藝研究

2.2.1 正交實驗設(shè)計

選擇乙醇體積濃度(A)、提取時間(B)、料液比(C)、提取次數(shù)(D)4 個因素為考察因素，每個因素3 個水平，以L9(34)正交設(shè)計表安排試驗，以三脈紫菀中總皂苷含量為評價指標(biāo)。因素水平表見表1。

表1 實驗因素水平表

2.2.2 正交實驗結(jié)果

分別精密稱取三脈紫菀藥材粉末50g，按照正交表的設(shè)計進(jìn)行實驗，用紫外分光光度法測定總皂苷含量，并進(jìn)行方差分析。結(jié)果見表2、3。根據(jù)表2中的極差R 值分析可知，各個因素對三脈紫菀總皂苷提取效果影響大小依次為A ＞C ＞D ＞B。方差分析結(jié)果(如表3)表明，乙醇濃度為影響總皂苷提取的顯著因素，而提取次數(shù)、料液比及提取時間對總皂苷的提取沒有顯著影響。以上分析綜合經(jīng)濟環(huán)保角度考慮，確定最佳提取工藝條件為A1C1D1B1，即50%乙醇、料液比為1∶6、回流提取2 次，每次1 小時。

表2 正交實驗結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

2.2.3 最佳提取工藝的驗證準(zhǔn)確稱取三脈紫菀根粉末5.0g，共3 份。按上述最佳提取工藝:即三脈紫菀藥材加6 倍量50%乙醇，回流提取2 次，1 小時/次。提取液濃縮定容至50mL 容量瓶中，取樣，顯色測定總皂苷含量。結(jié)果總皂苷的平均含量為75.23mg·g-1，總皂苷提取率為1.51%，RSD =1.56%(n =3)，說明此工藝條件穩(wěn)定、可行。

3 討論

前人對三脈紫菀的化學(xué)成分研究表明，齊墩果烷型三萜皂苷是其皂苷的主要存在形式［4-5］。鑒于此，本研究采用了齊墩果酸作為對照品。在選擇顯色劑方面，我們曾嘗試用香草醛-冰醋酸-濃硫酸法和香草醛-冰醋酸-高氯酸法分別對三脈紫菀總皂苷顯色，多次實驗表明，前者顯色更穩(wěn)定，且樣品與對照品的最大吸收波長對應(yīng)性好。因此本研究采用了香草醛-冰醋酸-濃硫酸顯色法。

在建立三脈紫菀總皂苷含量測定方法的基礎(chǔ)上，采用正交試驗對總皂苷的提取工藝進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明50%乙醇、料液比1∶6、回流提取2 次、1小時/次，所得總皂苷含量為75.23mg/g，RSD =1.56%(n=3)。該工藝簡便、實用，可以為三脈紫菀總皂苷的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

［1］鄭朝宗.浙江植物志(第6 卷)［M］.杭州:浙江科學(xué)技術(shù)出版社，

1993:238.

［2］劉可越，趙昱波，劉海軍，等.紫菀屬植物化學(xué)成分與生物活性研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2009，24(5):276 -278.

［3］周志望，黃慧蓮，邵峰，等.三脈紫菀總黃酮的提取純化工藝優(yōu)選［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18(18):7 -10.

［4］Yan F L，Wang A X，Jia Z J. Pentacyclic triterpenoids from Aster ageratoides var. pilosus［J］.Pharmazie，2004，59(11):882 -884.

［5］Sakai K，Nagao T，Okabe H. Triterpenoid saponins from the ground part of Aster ageratoides var. ovatus［J］. Phytochemistry，1999，51(2):309 -318.