枳殼醇提物與葡萄內(nèi)酯對血管性癡呆模型大鼠保護(hù)作用的實驗研究*

★ 李錦文 陳來 羅小泉＊＊ (. 江西省貴溪市人民醫(yī)院 貴溪335400;. 江西中醫(yī)學(xué)院 南昌

330009)

血管性癡呆(Vascular dementia，VD)系指在缺血性、出血性及急慢性缺血缺氧性腦血管疾病引起的腦組織損害基礎(chǔ)上產(chǎn)生的以高級神經(jīng)認(rèn)知功能障礙為主的一組臨床綜合征［1］。是我國最常見的老年癡呆類型之一。由于VD 嚴(yán)重危害患者的健康，同時給家庭和社會帶來巨大經(jīng)濟(jì)壓力和負(fù)擔(dān)，因此，關(guān)于VD 的發(fā)病機(jī)理與治療藥物的研究日益受到世界各國政府和學(xué)者的高度重視［2－3］。枳殼醇提脂溶性成分(含川陳皮素、橘皮內(nèi)酯、橘紅素和葡萄內(nèi)酯)。

大量文獻(xiàn)報道橘紅素，川陳皮素等具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、預(yù)防心血管疾病和神經(jīng)保護(hù)作用［4－9］，可以抑制腫瘤壞死因子TNF－α 表達(dá);同時文獻(xiàn)也報道葡萄內(nèi)酯是一種AchE 抑制劑［10－11］并對神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用［7－11］;但對枳殼醇提脂溶性成分與葡萄內(nèi)酯對血管性癡呆模型鼠的實驗研究還未見報道。本研究觀察枳殼醇提脂溶性成分與葡萄內(nèi)酯對結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈大鼠學(xué)習(xí)記憶改善的影響及對生化指標(biāo)的改變，探討枳殼醇提脂溶性成分與葡萄內(nèi)酯對血管性癡呆保護(hù)作用的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠130 只，體重200 ±20g(湖南斯萊克實驗動物有限公司，許可證號:SCXK(湘)2011 －0003，合格證號43004700000965)。

1.2 藥品與試劑

枳殼醇提物脂溶性部位(含川陳皮素、橘皮內(nèi)酯、橘紅素和葡萄內(nèi)酯);安理申(批號:071121A)衛(wèi)村(中國)藥業(yè)有限公司制造;MDA、SOD、AchE 測定試劑盒(批號均為:20100507)購于江蘇省南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器

UV － 1600 型分光光度計(北京瑞利公司);Morris 水迷宮硬件與視頻分析系統(tǒng)(北京天鳴宏遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司);高速離心機(jī)(美國Sigma 公司)。

2 方法

2.1 VD 動物模型制備

采用雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎模擬血管性癡呆。大鼠術(shù)前禁食12 小時、禁水4 小時。用10%水合氯醛(0.35mL/100g)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸前部備皮、消毒后，沿頸正中切開皮膚、肌肉，分離出雙側(cè)頸總動脈，套以“0”號絲線，分別結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈的遠(yuǎn)近端，確保阻斷動脈血流。術(shù)中大鼠體溫保持在(36.5 ±0.5)℃，以防止低溫對腦缺血保護(hù)作用。術(shù)后用青霉素鈉水溶液局部涂敷，預(yù)防感染。假手術(shù)組僅進(jìn)行頸前切開、分離，不結(jié)扎頸總動脈，其它同模型組操作。

2.2 動物分組及給藥

選擇96 只建模成功(雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎造模后無肢體殘疾的存活的大鼠)隨機(jī)分成8 組(模型組、陽性藥組、醇提物高中低組、葡萄內(nèi)酯高中低組)，每組12 只，另假手術(shù)組12 只。分別灌胃安理申混懸液0.5mL/100g(相當(dāng)于成人每日量的5mg/人·天)，1 次/天;枳殼醇提脂溶性浸膏3 組各0.5mL/100g(小、中、高劑量組分別為1g 浸膏/天、3g浸膏/天、6g 浸膏/天;葡萄內(nèi)酯3 組各0.5mL/100g(小、中、高劑量組分別為10mg/天、20mg/天、60mg/天;模型組與假手術(shù)組分別灌胃等體積的生理鹽水。共35 天。

2.3 動物行為學(xué)測試

采用Morris 水迷宮實驗方法測試大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。Morris 水迷宮的裝置由一不銹鋼圓形水池通過攝像機(jī)與電腦連接所組成。圓形不銹鋼直徑160cm、高50cm 的圓形水池，水池內(nèi)壁被漆為黑色，池內(nèi)水深25cm，水溫保持在(22 ±2)℃，房間內(nèi)光照恒定，無光線直射在水池內(nèi)。池壁上以四個等距離點將水池分為四個象限，在目標(biāo)象限(設(shè)為第三象限)內(nèi)距離池壁35cm 處放有一個直徑為12cm、高23cm 的圓形黑色站臺，站臺位于水面下2cm。池壁內(nèi)側(cè)貼有不同形狀的標(biāo)記物。迷宮上方安置連接顯示系統(tǒng)的攝像機(jī)，同步記錄大鼠運動軌跡。采用北京天鳴宏遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司研制開發(fā)的Morris 水迷宮視頻分析系統(tǒng)進(jìn)行信息處理。進(jìn)行定位航行實驗和空間探索實驗，共歷時6 天。

2.3.1 定位航行實驗

每天2 次，歷時5 天，跟蹤記錄大鼠游泳軌跡。將大鼠面向池壁，分別從4 個入水點下水，記錄在2分鐘內(nèi)尋找到平臺的時間(稱逃避潛伏期)，如果在2 分鐘以上未找到平臺，潛伏期記為120 秒。訓(xùn)練時實驗者可以幫助大鼠找到平臺，并停留10 秒。試驗完后將大鼠放回鼠籠中。在第5 天，選取離平臺最遠(yuǎn)象限作為入水點，此時大鼠的逃避潛伏期作為評價大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)。

2.3.2 空間探索試驗

定位航行試驗完成后(第6 天)撤去平臺，選擇離原平臺最遠(yuǎn)的象限為大鼠入水點，記錄大鼠的游泳軌跡和時間，并測定在2 分鐘內(nèi)第1 次跨越原平臺象限游泳的時間及頻率［次數(shù)/(2 分)］作為評價大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)。

2.4 組織形態(tài)學(xué)實驗

Morris 水迷宮實驗結(jié)束后，每組隨機(jī)選取2 只大鼠，10%水合氯醛(0.35mL/100g)腹腔注射麻醉。用0.9%的生理鹽水和4%多聚甲醛的磷酸緩沖液，灌注固定，逐級酒精脫水、透明、浸蠟、包埋，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋切片，厚5μm，蘇木精和伊紅染色，低倍鏡(10 ×10)確定海馬區(qū)位置，高倍鏡(10 ×40)觀察海馬CA1 區(qū)錐體層細(xì)胞的形態(tài)，在光鏡下拍照(見圖1)。

2.5 AchE、SOD 活性和MDA 含量測定

Morris 水迷宮實驗結(jié)束后，將各組大鼠處死，取腦稱重后加9 倍重量冰生理鹽水制備10%勻漿，離心10 －15 分鐘取上清。嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行AchE、SOD 活性和MDA 含量測定。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所有的數(shù)據(jù)以(ˉx±s)表示，采用SPSS11.5 進(jìn)行方差分析和多組間均數(shù)比較，P ＜0.05 為差異有顯著意義，P ＜0.01 為差異有極顯著意義。

3 結(jié)果

3.1 枳殼醇提物脂溶性部位與葡萄內(nèi)酯增強(qiáng)VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力

3.1.1 定位航行實驗

如表1 所示，葡萄內(nèi)酯小、中、高劑量組和浸膏高劑量組大鼠逃避潛伏期則較模型組明顯縮短，具有顯著性差異(P ＜0.05)。陽性藥對照組和浸膏小、中劑量組大鼠逃避潛伏期則較模型組明顯縮短的趨勢，可能給藥劑量小。

表1 定位航行逃避潛伏期(ˉx±s，n=12)

1.2 空間探索實驗

如表2 所示，葡萄內(nèi)酯小、中、高劑量組跨越原平臺次數(shù)與模型組比較具有顯著性差異(P ＜0.05)。陽性藥對照組和浸膏小、中、高劑量組跨越原平臺次數(shù)與模型組比較具有明顯改善。大鼠逃避潛伏期則較模型組有明顯縮短的趨勢。

表2 空間探索結(jié)果(ˉx±s，n=12)

3.2 枳殼醇提脂溶性部位與葡萄內(nèi)酯改善VD 大鼠海馬CA1 區(qū)病理改變

如圖b 所示，HE 染色觀察到模型組大鼠海馬CA1 區(qū)表現(xiàn)出明顯的缺血性病理改變，核固縮和細(xì)胞呈無秩序排列。如圖a、c 和d 所示，假手術(shù)組、給藥組(浸膏高劑量組和葡萄內(nèi)酯組)和陽性藥組大鼠海馬CA1 區(qū)組織結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元排列整齊、規(guī)則。

圖1 典型海馬錐體細(xì)胞照片(HE×400)

3.3 枳殼醇提脂溶性部位與葡萄內(nèi)酯對VD 大鼠腦組織AchE、SOD 活性和MDA 含量的影響

表3 表明，假手術(shù)組、葡萄內(nèi)酯低、中、高劑量組和枳殼醇提脂溶性部位低、中、高劑量組與模型組相比，大腦組織中AchE 活性明顯高于模型組，有顯著性差異(P ＜0.05)。而假手術(shù)組、葡萄內(nèi)酯低、中、高劑量組和枳殼醇提脂溶性部位低、中劑量組的腦組織中SOD 活性低于模型組，這可能與造模時大鼠處在低溫有關(guān)，需進(jìn)一步驗證。假手術(shù)組、葡萄內(nèi)酯低、中、高劑量組和枳殼醇提脂溶性部位低、中劑量組的腦組織中MDA 含量明顯低于模型組MDA 含量，有顯著性差異(P ＜0.05)。

表3 各組大鼠AchE、SOD 活力和MDA 含量變化(ˉx±s，n=12)

4 討論

采用永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈建立的血管性癡呆模型的模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長，穿越平臺的次數(shù)明顯減少，表現(xiàn)出一定的癡呆癥狀。與假手術(shù)組無論是學(xué)習(xí)記憶能力(定位航行和空間探索)還是生化指標(biāo)的檢測(AchE、SOD 活力和MDA含量變化)均存在顯著性差異。

中樞膽堿系統(tǒng)功能下降導(dǎo)致認(rèn)知能力受損，表現(xiàn)為膽堿能神經(jīng)功能下降。乙酰膽堿(Ach)降解加快。由于乙酰膽堿性質(zhì)極不穩(wěn)定，容易出現(xiàn)水解極難準(zhǔn)確測定其含量。而乙酰膽堿酯酶(AchE)是Ach 的降解酶，測定腦組織中AchE 的活性可以判斷Ach 含量的變化［12］因而被認(rèn)為是膽堿能神經(jīng)元的重要標(biāo)志酶。葡萄內(nèi)酯各劑量組及醇提物高劑量組均能降低AchE 的活性，從而促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Ach 的遞質(zhì)水平。這種提高Ach 的方法已經(jīng)成為治療VD 和AD 等慢性神經(jīng)組織退化病變最有希望的途徑之一。

SOD 是機(jī)體內(nèi)自由基的清除劑，可以減少自由基對腦組織的損傷作用。本實驗結(jié)果顯示，與模型組比較，葡萄內(nèi)酯低、中、高劑量組和枳殼醇提脂溶性部位低、中劑量組的腦組織中SOD 活性反而降低;與假手術(shù)組比較，模型組的SOD 活力升高，其原因可能為造模后大鼠由于缺血缺氧，對急劇增長的活性氧的一種過激反應(yīng)。

從病理改變來看，枳殼醇提脂溶性部位高劑量組與葡萄內(nèi)酯各組均能顯著改善，定位航行枳殼醇提脂溶性部位高劑量組與葡萄內(nèi)酯各組與模型組比較也有顯著差異，而醇提脂溶性部位的中、低劑量只有好轉(zhuǎn)趨勢卻沒有統(tǒng)計學(xué)意義。由此推測葡萄內(nèi)酯是主要的藥效物質(zhì)。葡萄內(nèi)酯分子量小(298.38)、脂溶性強(qiáng)、易透過血腦屏障，通過對AchE 的抑制達(dá)到增加Ach 在腦中的含量，從而促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Ach 的遞質(zhì)水平，從而對血管性癡呆起到改善作用。其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

［1］李學(xué)松，王劍鋒.血管性癡呆的臨床研究進(jìn)展［J］.神經(jīng)疾病與精神衛(wèi)生，2004，4(2):122.

［2］趙云云，付華斌，張偉.血管性癡呆的臨床研究進(jìn)展［J］. 白求恩軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，6(2):101.

［3］Myron DG. Neuroprotection for ischemic stroke:Past，present and future［J］.Neuropharmacology，2008，55:363.

［4］John A. Manthey，Najla Guthrie and Karel Grohmann. Biological Properties of Citrus Flavonoids Pertaining to Cancer and Inflammation［J］.Current Medicinal Chemistry，2001，8(2):135.

［5］Cheol－Hee Choi，Kyung－Hoon Sun，Chun－San An，etc. Reversal of P－glycoprotein－mediated multidrug resistance by 5，6，7，3＇，4＇－ pentamethoxyflavone (Sinensetin)［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications，2002，295(4):832.

［6］趙國華，陳宗道.柑桔類黃酮生物活性的研究進(jìn)展［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，27(3):23.

［7］Thomas Walle. Methoxylated flavones，a superior cancer chemopreventive flavonoid subclass［J］. Seminars in Cancer Biology，2007(17):354.

［8］Soo－Youn Choi ，Joon－Ho Hwang ，Hee－Chul Ko ，et al. Nobiletin from citrus fruit peel inhibits the DNA －binding activity of NF－Band ROS production in LPS －activated RAW 264.7 cells［J］.Journal of Ethnopharmacology，2007，113:149.

［9］Heather E. Kleiner，Xiaojun Xia，Junichiro Sonoda，et al. Effects of naturally occurring coumarins on hepatic drug metabolizing enzymesin mice［J］.Toxicology and Applied Pharmacology，2008，232:337.

［10］Mitsuo Miyazawa，Hideyuki Tougo，and Masakazu Ishihara. Inhibition of Acetylcholinesterase Activity by Essential oil from Citrus paradisi. Nutural Product Letters，2001，15(3):205.

［11］Kayo Kuroyanagi，Min－Sook Kang，Tsuyoshi Goto，et al.，Citrus auraptene acts as an agonist for PPARs and enhances adiponectin production and MCP － 1 reduction in 3T3 － L1 adipocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications，2008，366:219.

［12］Kobayashi Ms，Han D，Packe L，et al. Antioxidants and herbal extracts protect HT－4neuronal cells against glutamate－induced eytotoxicity［J］.Free Radic Res，2000，32(2):115.