屈洪波， 吳誠義△， 范原銘， 韓明利， 陳 鑫， 湯為學(xué)

(1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌外科，2 重慶市神經(jīng)病學(xué)重點實驗室，重慶400016)

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)指的是上皮細(xì)胞失去其上皮樣表型，獲得間質(zhì)樣表型的過程，其相反過程稱之為間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal-epithelial transition，MET)，兩者不僅在胚胎發(fā)育、損傷修復(fù)及組織歸巢中發(fā)揮重要作用，也在腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵性作用［1-3］。2007 年，Mani 等［4］發(fā)現(xiàn)叉頭框C2(forkhead box C2，F(xiàn)OXC2)通過調(diào)控EMT 參與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移，可能是基底樣乳腺癌預(yù)后判斷的一種重要分子標(biāo)志物。類似的，Zagouri 等［5］發(fā)現(xiàn)MET 現(xiàn)象在三陰乳腺癌中頻繁出現(xiàn)可能是其不良預(yù)后的表現(xiàn)。最近，Yu 等［6］研究證實循環(huán)腫瘤細(xì)胞通過在EMT 和MET 中動態(tài)表達(dá)轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)信號分子和FOXC1 轉(zhuǎn)錄因子，從而逃避化療的殺傷作用。目前，有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子FOXC2 在乳腺癌EMT 中的作用及機制的研究尚未見報道。因此，我們擬建立TGF-β1誘導(dǎo)的乳腺癌MCF-7 細(xì)胞EMT模型和FOXC2 基因RNA 干擾慢病毒表達(dá)載體，探討沉默F(xiàn)OXC2 表達(dá)對TGF-β1誘導(dǎo)的MCF-7 細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的逆轉(zhuǎn)作用及對乳腺癌侵襲性的影響，為針對于乳腺癌的靶向治療提供新的線索。

材 料 和 方 法

1 材料

人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，慢病毒包裝質(zhì)粒:pGCL-GFP-LV、pHelper1.0 及pHelper2.0 購自上海吉凱基因公司;大腸桿菌DH5α由重慶市神經(jīng)病學(xué)實驗室保存;限制性內(nèi)切酶Age I和EcoR I、瓊脂糖凝膠回收試劑盒及T4 連接酶(NEB);質(zhì)粒DNA 提取試劑盒(Qiagen)，Lipofectamine 2000(Invitrogen);人重組TGF-β1(Pepro-Tech);單克隆山羊抗人FOXC2 和單克隆鼠抗人上皮性鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)、緊密連接蛋白1(claudin-1，CLDN1)、纖維連接蛋白1(fibronectin-1，F(xiàn)N1)及β-actin 抗體(Santa Cruz);FITC 標(biāo)記兔抗鼠II 抗和TRITC 標(biāo)記的兔抗鼠II 抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);總蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒、DAPI 染色液及HRP 標(biāo)記的兔抗鼠II 抗和兔抗山羊II 抗(碧云天生物技術(shù)研究所);總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA 聚合酶及DNA marker(大連寶生物工程有限公司);PCR 引物設(shè)計及合成(上海生工生物工程公司);Transwell 小室(Millipore)，胎牛血清及DMEM 高糖培養(yǎng)基(Gibco)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和MCF-7 細(xì)胞EMT 模型的建立 乳腺癌MCF-7 細(xì)胞在37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，用含有10% 胎牛血清、1 ×105U/L 青霉素、100 mg/L 慶大霉素及5 U/L 胰島素的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。用0.25% 胰酶消化傳代，待細(xì)胞生長至板底70% ～80%后，換成無血清培養(yǎng)基饑餓過夜，再加入含有5 μg/L TGF-β1的高糖DMEM 培養(yǎng)基誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞EMT 發(fā)生，期間適時加入含有TGFβ1的完全培養(yǎng)基維持間質(zhì)狀態(tài)，倒置相差顯微鏡下觀察不同時間下的細(xì)胞形態(tài)。

2.2 免疫熒光染色檢測MCF-7 細(xì)胞上皮和間質(zhì)相關(guān)標(biāo)志物表達(dá) 將MCF-7 細(xì)胞以1 ×108/L 密度接種于24 孔板中預(yù)置的蓋玻片上，待細(xì)胞貼壁后換成無血清培養(yǎng)基饑餓過夜，加入5 μg/L TGF-β1的高糖DMEM 培養(yǎng)基誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞EMT 發(fā)生，96 h 后取出蓋玻片，0.4%多聚甲醛固定20 min，如果抗原為核表達(dá)需用0.5% Triton X-100 透膜15 min;用5%BSA 封閉30 min，加入單克隆鼠抗人E-cad、CLDN1和FN1 的I 抗(濃度均為1∶50)，4 ℃孵育過夜，加FITC 或TRITC 標(biāo)記的兔抗鼠Ⅱ抗(濃度均為1∶50)，37 ℃下避光孵育1.5 h，PBS 沖洗3 次后加DAPI 染色液，室溫作用15 min，緩沖甘油封固，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.3 人FOXC2 基因RNA 干擾慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定 選擇GenBank 中人FOXC2 基因編碼區(qū)序列(NM_005251.2)作為分析序列。設(shè)計及合成FOXC2基因的siRNA 寡核苷酸序列和發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)的雙鏈OligoDNA。構(gòu)建各個干擾序列的表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞，根據(jù)FOXC2 抑制率，確定最終有效靶序列為5'-CTACCTGAGCGAGCAGAAT-3'，由上海吉凱基因公司合成。其siRNA 的DNA Oligo:5'-CCG GCTACCTGAGCGAGCAGAATCTCGAGATTCTGCTCGCTCAGGTAGTTTTTG-3'。陰性對照的核心序列為5'-TT CTCCGAACGTGTCACGT-3'，其DNA Oligo:5'-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTACGTGACACGTTCGGAGA-ATTTTTG-3'。寡核苷酸經(jīng)退火形成雙鏈DNA。經(jīng)T4 連接酶與Age I 和EcoR I 雙酶切后的pGCL-GFP載體連接，形成表達(dá)siRNA 的重組慢病毒質(zhì)粒載體(pGCL-GFP-FOXC2-siRNA)，經(jīng)酶切鑒定。轉(zhuǎn)化DH5α 大腸桿菌，搖菌后接種到含氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)16 h，挑取重組陽性克隆行PCR 篩選。

2.4 慢病毒包裝及滴度測定 以Qiagen 公司的質(zhì)粒抽提試劑盒對慢病毒包裝系統(tǒng)中3 種質(zhì)粒:表達(dá)最有效靶序列siRNA 的重組慢病毒質(zhì)粒載體pGCGFP-LV、pHelper1.0 及pHelper2.0，分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素DNA 抽提，質(zhì)粒DNA 溶于除菌的TE 中，以紫外光吸收法測定其濃度及純度，保證所提質(zhì)粒DNA 的A260/A280在1.8 ～2.0 之間。按說明共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，8 h 后更換為完全培養(yǎng)基，48 h 后收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，對濃縮后得到高滴度的慢病毒液，以293T 細(xì)胞GFP 蛋白的表達(dá)水平經(jīng)孔稀釋法測定病毒滴度。

2.5 乳腺癌MCF-7 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將TGF-β1誘導(dǎo)成功后的間質(zhì)化的MCF-7 細(xì)胞分為3 組:未轉(zhuǎn)染組、control-siRNA 組及FOXC2 -siRNA 組。在6 孔培養(yǎng)板每孔中接種2 ×105個細(xì)胞，待其生長至底板30% ～50%時，按感染復(fù)數(shù)(MOI =20)加入慢病毒顆粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗，以空載體病毒液作為對照，48 h后倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)情況。2 周后采用流式分選出GFP 陽性表達(dá)的細(xì)胞，通過RTPCR 和Western blotting 檢測FOXC2 mRNA 及蛋白表達(dá)情況。

2.6 RT-PCR 檢測MCF-7 細(xì)胞中E-cad、CLDN1 及FN1 mRNA 表達(dá) 將TGF-β1誘導(dǎo)的間質(zhì)化MCF-7細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染，并分選出GFP+細(xì)胞擴大培養(yǎng)，待長至瓶底80%后，加入Trizol 試劑常規(guī)抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以β-actin 為內(nèi)參照，檢測目的基因表達(dá)變化，β-actin 上游引物5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'，下游引物5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3';FOXC2 上游引物5'-CTCAACGAGTGCTTCGTCAA-3'，下游引物5'-GCTCCTCCTTCTCCTTGGAC-3';E-cad 上游引物 5'-TTGCTACTGGAACAGGGACAC-3'，下游引物5'CCCGTGTGTTAGTT CTGCTGT-3';CLDN1 上游引物5'-AGAAGATGAGGATGGCTGTCA-3'，下游引物5'-TTGGTGTTGGGTAAGAG GTTG-3';FN1 上游引物5'-G CCTTCAAGTTCCTGTTAC-3'，下游引物5'-GACTCTCTCCGCTTGG ATTCT-3'。設(shè)置反應(yīng)參數(shù):95 ℃預(yù)變性15 s，95 ℃10 s，58℃30 s，72 ℃1 min，共進(jìn)行35 個循環(huán)。RT-PCR 產(chǎn)物條帶采用Quantity One 軟件分析，以β-actin 為內(nèi)參照，以目的基因灰度值/β-actin 灰度值計算mRNA相對表達(dá)量，以上實驗重復(fù)3 次，取平均值。

2. 7 Western blotting 檢測MCF-7 細(xì)胞中E-cad、CLDN1 及FN1 蛋白表達(dá) 將TGF-β1誘導(dǎo)的間質(zhì)化MCF-7 細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染、分選出GFP+細(xì)胞擴大培養(yǎng)，收集細(xì)胞后，加入RIPA 裂解液及PMSF，冰上靜置30 min。4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，將上清移至一新的EP 管中，BCA 法測定蛋白濃度，沸水煮5 min后上樣，采用8%SDS-PAGE 電泳，先用40 V 電泳30 min 左右至跑到分離膠處，再改為80 V 電泳1.5 h左右，直至溴酚藍(lán)跑至底部。做好“三明治”夾板，250 mA 恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h，20 mL 封閉液37 ℃孵育2 h，加入單克隆鼠抗人E-cad、CLDN1 和FN1 的Ⅰ抗(濃度均為1∶200)，4℃孵育過夜，次日TBST 洗膜3次，HRP 標(biāo)記的兔抗鼠Ⅱ抗(濃度均為1∶1 000)，37℃孵育1.5 h，TBST 洗膜3 次。ECL 化學(xué)發(fā)光試劑孵育1 min，置于暗盒內(nèi)曝光拍照，曝光時間30 s。以β-actin 為內(nèi)參照，以目的蛋白灰度值/β-actin 灰度值計算目的蛋白相對表達(dá)量。以上實驗重復(fù)3 次，取平均值。

2.8 Transwell 小室檢測MCF-7 細(xì)胞的侵襲能力

將MCF-7 細(xì)胞分為3 組:空白對照組、TGF-β1誘導(dǎo)組和FOXC2-siRNA 組，每組設(shè)3 個復(fù)孔。各組細(xì)胞用0.25%胰酶消化后，用含10% 胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基重懸為1 ×108/L。每個Transwell 上室加入0.3mL 這種細(xì)胞懸液(約3 ×104細(xì)胞)，下室加入0.6 mL 含10% 胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h 后，取出小室并棄去上室液體，用棉簽擦去膜上層細(xì)胞，4%多聚甲醛液固定15 min，瑞氏染色液染色20 min，于倒置相差顯微鏡下計數(shù)膜下層的細(xì)胞。200 倍光鏡隨機選擇10 個視野計數(shù)，計算平均值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計分析軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，組間均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TGF-β1 誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化觀察

MCF-7 細(xì)胞經(jīng)5 μg/L TGF-β1誘導(dǎo)的第3 天，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，倒置相差顯微鏡觀察顯示，第0 d 未處理的MCF-7 細(xì)胞呈現(xiàn)典型上皮細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞排列緊密;而經(jīng)TGF-β1處理后，大部分細(xì)胞喪失了多角形上皮表型，細(xì)胞明顯拉長，細(xì)胞間連接更疏松，取而代之的為一種梭形、纖維細(xì)胞樣及間質(zhì)細(xì)胞樣形態(tài)，見圖1。

Figure 1. The morphology of MCF-7 cells induced by TGF-β1(×100).A:the cells showed multi-angle shape or epithelial phenotype characteristics in control group (0 d);B，C:the cells showed spindle-shaped changes in TGF-β1 group (3 d and 6 d，respectively).圖1 TGF-β1 誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞發(fā)生EMT 時的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

2 TGF-β1 誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞EMT 后上皮和間質(zhì)相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)

經(jīng)5 μg/L TGF-β1處理MCF-7 細(xì)胞96 h 后，免疫熒光染色顯示，相比于對照組，上皮性標(biāo)志物Ecad 和CLDN1 在細(xì)胞膜表達(dá)明顯減少，而間質(zhì)性標(biāo)志物FN1 表達(dá)明顯增加，見圖2。

Figure 2. The expression of the markers related to EMT in MCF-7 cells induced by TGF-β1(×200).Yellow arrows indicate positive expression.圖2 TGF-β1 誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞EMT 后EMT 相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)

3 重組慢病毒載體滴度的測定及MCF-7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

采用逐孔稀釋法，轉(zhuǎn)染96 h 后，熒光顯微鏡可見不同稀釋倍數(shù)下熒光細(xì)胞所占比例，根據(jù)不同病毒顆粒數(shù)計算出病毒滴度為7 ×1014Tu/L，說明有大量質(zhì)粒進(jìn)入感染細(xì)胞，病毒包裝成功。使用上述2 組病毒顆粒感染MCF-7 細(xì)胞，12 h 后觀察未見細(xì)胞明顯死亡，說明FOXC2-siRNA 慢病毒本身對細(xì)胞無明顯毒害作用，實驗組與對照組之間無明顯差異。轉(zhuǎn)染12 h 后，更換為完全培養(yǎng)基，48 h 后觀察有熒光蛋白表達(dá)，且表達(dá)量在96 h 達(dá)到最大，感染效率＞80%，并在之后保持在高表達(dá)狀態(tài)，沒有明顯下降，可用于后續(xù)實驗，見圖3。

Figure 3. The green fluorescent protein expression in MCF-7 cells transfected FOXC2-siRNA lentiviral vector observed by fluorescent microscope (×200).A:inverted phase-contrast microscope;B:fluorescent microscope;C:merged.圖3 FOXC2-siRNA 慢病毒轉(zhuǎn)染MCF-7 細(xì)胞的綠色熒光蛋白表達(dá)

4 沉默F(xiàn)OXC2 表達(dá)對TGF-β1 誘導(dǎo)的MCF-7 細(xì)胞EMT 相關(guān)標(biāo)志物mRNA 表達(dá)的影響

RT-PCR 凝膠電泳條帶顯示，F(xiàn)OXC2-siRNA 組、control-siRNA 組及未轉(zhuǎn)染組FOXC2 mRNA 表達(dá)量分別為0.08 ±0.01、0.44 ±0.06 和0.59 ±0.08;E-cad mRNA 表達(dá)量分別為0.67 ± 0.11、0.41 ± 0.08 和0.53 ±0.09;CLDN1 mRNA 表達(dá)量分別為:0.56 ±0.07、0.23 ±0.04 和0.21 ±0.03;FN1 mRNA 表達(dá)量分別為0.07 ±0.01、0.64 ±0.08 和0.75 ±0.12。與control-siRNA 組及未轉(zhuǎn)染組比較，F(xiàn)OXC2-siRNA 組上皮性標(biāo)志物E-cad 和CLDN1 明顯上調(diào)，而間質(zhì)性標(biāo)志物FN1 明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖4。

5 沉默F(xiàn)OXC2 表達(dá)對TGF-β1誘導(dǎo)的MCF-7 細(xì)胞EMT 相關(guān)標(biāo)志物蛋白表達(dá)的影響

Western blotting 凝膠成像條帶顯示，與未轉(zhuǎn)染組及control-siRNA 組比較，F(xiàn)OXC2-siRNA 組FOXC2 蛋白的表達(dá)明顯降低，F(xiàn)OXC2 下游E-cad 及CLDN1 表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)性標(biāo)志物FN1 表達(dá)下調(diào)，3 組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖5。

Figure 4. The mRNA expression of FOXC2 (A)and the markers related to EMT (B:E-cad;C:CLDN1;D:FN1)in mesenchymal MCF-7 cells analyed by RT-PCR.M:marker;1:FOXC2-siRNA group;2:control-siRNA group;3:non-transfection group.圖4 RT-PCR 檢測間質(zhì)化MCF-7 細(xì)胞中FOXC2 和EMT 相關(guān)標(biāo)志物mRNA 的表達(dá)

Figure 5. The protein expression of FOXC2 and EMT-related markers in mesenchymal MCF-7 cells analyed by Western blotting.1:non-transfection group;2:control-siRNA group;3:FOXC2-siRNA group.Mean±SD. n=3. * P ＜0.05 vs non-transfection or control-siRNA.圖5 Western blotting 檢測間質(zhì)化MCF-7 細(xì)胞中FOXC2 EMT 相關(guān)標(biāo)志物蛋白的表達(dá)

6 沉默F(xiàn)OXC2 表達(dá)對TGF-β1 誘導(dǎo)的MCF-7 細(xì)胞侵襲能力的影響

對照組、TGF-β1組和FOXC2-siRNA 組穿過人工基質(zhì)膠的間質(zhì)化MCF-7 細(xì)胞的數(shù)目分別為16 ±3、52 ±6 及13 ±2，TGF-β1組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯高于其它2 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖6。

Figure 6. Impact of FOXC2 silencing on invasion of mesenchymal MCF-7cell was assayed using Transwell chambers(×200).A:control group;B:TGF-β1-induced group;C:FOXC2-siRNA group.圖6 沉默F(xiàn)OXC2 對間質(zhì)化MCF-7 細(xì)胞體外侵襲能力的影響

討 論

EMT 在多種腫瘤演進(jìn)中扮演重要角色，有些是瞬時事件，有些表現(xiàn)為永久性EMT 特征。EMT 使得上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性及與基底膜連接等上皮樣特征，而獲得高遷移、侵襲、抗凋亡及降解細(xì)胞外基質(zhì)等間質(zhì)樣特征［7］。EMT 發(fā)生受到諸多因素的影響，其中TGF-β1是誘發(fā)EMT 的關(guān)鍵始動因素，TGF-β1可通過Smad 或非Smad 信號通路誘導(dǎo)某些上皮細(xì)胞發(fā)生EMT［8-9］。

研究表明，一些重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，如Twist、Snail1、Slug、FOXC2、ZEB1/2 等能夠誘導(dǎo)EMT 發(fā)生，它們共同特征是含有能識別靶基因啟動子上E-box基序的DNA 結(jié)合序列［10-11］。更多的EMT 相關(guān)標(biāo)志物鑒定，為EMT 模型的建立提供理論依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，MCF-7 細(xì)胞在外源性TGF-β1誘導(dǎo)下，48 h 內(nèi)顯示出細(xì)胞生長抑制現(xiàn)象，這與先前推論的TGF-β1在早期對細(xì)胞表現(xiàn)為生長抑制一致，從第3 d 開始至第6 d，細(xì)胞逐漸拉長，形成長梭形具有運動能力的成纖維樣細(xì)胞，說明EMT 轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量需要積累到一定濃度才能與E-cad 的啟動子結(jié)合抑制其表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞間連接的松散，可能是因為從轉(zhuǎn)錄到翻譯，再到蛋白質(zhì)合成并發(fā)揮作用需要一定的時間，說明MCF-7 細(xì)胞EMT 過程表現(xiàn)出時序特征［12-13］。而免疫熒光檢測結(jié)果也顯示上皮性標(biāo)志物E-cad 及CLDN1 在TGF-β1誘導(dǎo)的MCF-7 細(xì)胞膜上表達(dá)降低，而FN1 在間質(zhì)樣細(xì)胞中表達(dá)明顯增加。Gerhard等［14］在化生性乳腺癌研究中，發(fā)現(xiàn)claudins 蛋白及E-cad 蛋白表達(dá)缺失或降低與波形蛋白高表達(dá)及癌干細(xì)胞表型相關(guān)，表明化生性乳腺癌具有低緊密連接蛋白特征。其它研究也發(fā)現(xiàn)EMT 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子高表達(dá)與Claudin-low 及化生性乳腺癌表型相關(guān)［10］。類似的，Jung 等［15］發(fā)現(xiàn)claudin-1、claudin-2、claudin-3及claudin-4 的低表達(dá)與胃癌的侵襲性及不良預(yù)后相關(guān)。

FOXC2 屬于人類叉頭框(forkhead box，F(xiàn)OX)家族成員之一，F(xiàn)OX 蛋白不僅作為典型轉(zhuǎn)錄因子通過招募共激活因子等調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，有些還能直接同凝聚染色質(zhì)結(jié)合參與重構(gòu)，協(xié)同其它轉(zhuǎn)錄因子參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，PI3K/Akt、TGF-β/Smad 和MAPK 等多個信號通路都可以影響FOX 蛋白磷酸化水平，調(diào)節(jié)其活性。新近研究發(fā)現(xiàn)FOX 蛋白家族中的多個成員通過調(diào)控上皮細(xì)胞可塑性，在腫瘤惡性進(jìn)展中發(fā)揮著促進(jìn)或抑制作用［16］。如牟永告等［17］研究顯示核轉(zhuǎn)錄因子FOXP3 陽性的星形細(xì)胞瘤較FOXP3 陰性的星形細(xì)胞瘤的預(yù)后差，可能成為星形細(xì)胞瘤免疫調(diào)節(jié)的新靶點。而蔣光愉等［18］研究顯示FOXA1 及BRCA1 在三陰乳腺癌中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示FOXA1在乳腺癌中發(fā)揮著抑癌作用。目前，有關(guān)FOXC2 在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中作用及其是否參與TGF-β1調(diào)控的EMT 機制，仍不清楚。為此，我們構(gòu)建FOXC2 基因RNA 干擾慢病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至間質(zhì)化MCF-7細(xì)胞中，RT-PCR 及Western blotting 結(jié)果均顯示間質(zhì)性標(biāo)志物FN1 表達(dá)下調(diào)，而上皮性標(biāo)志物E-cad 及CLDN1 表達(dá)上調(diào)，提示EMT 過程發(fā)生逆轉(zhuǎn)，即FOXC2 可逆轉(zhuǎn)間質(zhì)化MCF-7 細(xì)胞回復(fù)到上皮表型，這與EMT 機制可逆性，即MET 機制相符［19-20］。而Transwell 小室模型也證明沉默F(xiàn)OXC2 表達(dá)能夠顯著降低穿過人工基質(zhì)基底膜間質(zhì)化的MCF-7 細(xì)胞數(shù)量，且穿過基底膜的細(xì)胞形態(tài)學(xué)回復(fù)至上皮表型，不僅表明乳腺癌細(xì)胞侵襲能力受到抑制，同時也表明EMT 是一種動態(tài)及可逆的過程。以上結(jié)果表明FOXC2 可能作為TGF-β1下游靶基因參與MCF-7 細(xì)胞EMT 和MET 的調(diào)控。

綜上所述，外源性TGF-β1能夠誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞發(fā)生EMT，沉默F(xiàn)OXC2 表達(dá)可逆轉(zhuǎn)EMT 發(fā)生并降低其侵襲轉(zhuǎn)移能力，提示FOXC2 在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用;而FOXC2 作為轉(zhuǎn)錄因子，處于信號通路級聯(lián)反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，對其上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控的直接靶基因尚有待進(jìn)一步研究。

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