徐 菁， 覃艷紅， 張翠明， 喬愛(ài)秀， 李靈敏， 王宏偉

(山西醫(yī)科大學(xué)1病理教研室，2第二醫(yī)院血液病研究所，3第二醫(yī)院超聲診斷科，山西 太原030001)

WT1(Wilms tumor 1)蛋白作為一種重要的轉(zhuǎn)錄 調(diào)控因子參與許多腫瘤特別是白血病的發(fā)生。WT1 mRNA 經(jīng)過(guò)選擇性剪接可以編碼4 種同源異構(gòu)體。在第5 外顯子處，編碼17 個(gè)氨基酸插入調(diào)控區(qū)與鋅指區(qū)之間，可把WT1 蛋白分為17AA+及17AA-2 種異構(gòu)體。在第9 外顯子末端即第3 和第4 鋅指結(jié)構(gòu)之間插入KTS(Lys-Thr-Ser)3 個(gè)氨基酸，從而又可將WT1 表達(dá)蛋白分為KTS+和KTS-2 種異構(gòu)體。通過(guò)不同的組合，可細(xì)分為4 種主要的剪接體，這4 種不同的含鋅指結(jié)構(gòu)的DNA 結(jié)合蛋白分別為17AA+/KTS+、17AA+/KTS-、17AA-/KTS+和 17AA-/KTS-。4 種異構(gòu)體比例的嚴(yán)格平衡在細(xì)胞增殖、分化和凋亡的調(diào)節(jié)等方面起著重要作用［1-2］。

我們的前期工作證實(shí)人急性髓系白血病細(xì)胞系HL-60 中4 種WT1 異構(gòu)體同時(shí)存在，在全反式維甲酸誘導(dǎo)分化前以17AA+/KTS+異構(gòu)體為主，而分化后以17AA-/KTS-為主［3］。為了進(jìn)一步明確WT1及其異構(gòu)體在白血病中的作用，我們將WT1(17AA-/KTS-)異構(gòu)體轉(zhuǎn)染白血病細(xì)胞系HL-60 細(xì)胞，從而將HL-60 細(xì)胞中WT1 異構(gòu)體表達(dá)的比例由17AA+/KTS+優(yōu)勢(shì)型轉(zhuǎn)變?yōu)?7AA-/KTS-優(yōu)勢(shì)型，探討WT1 異構(gòu)體比例的轉(zhuǎn)變對(duì)HL-60 細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

PCDH1-MCS1-EF1-copGFP(簡(jiǎn)稱PCDH1)，全長(zhǎng)約7.5 kb，為帶有SV40 和PCMV 啟動(dòng)子、具有氨芐青霉素抗性基因的慢病毒質(zhì)粒載體，其與大腸桿菌DH5α、白血病細(xì)胞系HL-60 細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保存。三氧化二砷(As2O3)注射液購(gòu)自哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)有限公司。RPMI-1640 培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco/BRL。限制性內(nèi)切酶Xba Ⅰ、EcoRⅠ及熒光定量試劑盒等均購(gòu)自TaKaRa。脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 購(gòu)自Invitrogen，引物及探針為上?；倒竞铣?。針對(duì)WT1 蛋白C 末端的抗C-19 兔抗人多克隆抗體和羊抗兔Ⅱ抗為Santa Cruz 產(chǎn)品，MTT 購(gòu)自Sigma，Annexin V/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Coulter。

2 重組質(zhì)粒PCDH1-WT1(17AA－ /KTS－)的構(gòu)建

根據(jù)WT1(17AA-/KTS-)異構(gòu)體的全長(zhǎng)cDNA序列，使用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，分別在其上、下游引物5’端引入限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和Xba I 識(shí)別位點(diǎn)，上游引物為5’-CCGGAATTCTCAAAGCGCCAGCTGGAG-3’，下游引物為5’-GCTCTAGAATGCAGGACCCGGCTTC-3’(下劃線為引入的酶切位點(diǎn));從HL-60 細(xì)胞中提取總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄，以cDNA 為模板擴(kuò)增全長(zhǎng)WT1(17AA-/KTS-)基因序列，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ對(duì)純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)質(zhì)粒PCDH1 進(jìn)行雙酶切，回收并純化，T4 DNA 連接酶連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，氨芐青霉素篩選挑取單克隆菌落，擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定。

3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

采用LipofectamineTM2000 進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，生長(zhǎng)良好的HL-60 細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前24 h 接種到6 孔板中，待細(xì)胞總面積達(dá)到60% ～80%，取3 μg 重組質(zhì)粒PCDH1-WT1(17AA-/KTS-)和空載體PCDH1 分別進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染(具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)，用600 mg/L G418 篩選具有抗性的細(xì)胞克隆，挑取克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。

4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)

引物及探針自行設(shè)計(jì)，由上海基康公司合成，引物及探針序列為:總WT1 探針，5’-FAM-CGGAGCCCAATACA-MGB-3’，上游引物5’-GATAACCACACAACGCCCATC-3’，下 游 引 物 5’-CACGTCGCACATCCTGAATG-3’;17AA+探針:5’-FAM-CAGCACAGGGATCGAGA-MGB-3’，上 游 引 物 5’-TGGACAGAAGGGCAGAGCA-3’，下 游 引 物 5’-GGATGGGCGTTGTGTGGT-3’;KTS+探針，5’-FAM-TTCCGGTCCGACCA-MGB-3’，上游引物5’-CAAAAGACACCAAAGGAGACATACA-3 ’，下 游 引 物 5 ’-CTGAAGGGCTTTTCACTTGTTTTAC-3’;β-actin 探 針，5’-FAM-ATCATTGCTCCTCCTGAG-MGB-3’，上游引物5’-GCTCAAAAGACACCAAAGGAGAC-3’，下游引物 5 ’-AGCTGAAGGGCTTTTCACTTGTTT-3 ’。 將WT1/β-actin、17AA+/β-actin 和KTS+/β-actin 分別作為WT1 基因及17AA+、KTS+異構(gòu)體的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)條件參見(jiàn)文獻(xiàn)［3］。

5 Western blotting 檢測(cè)蛋白表達(dá)

收集細(xì)胞各1 ×107，溶解于裂解緩沖液(PBS中含10 g/L NP40、5 g/L 脫氧膽酸鈉、1 g/L SDS、1 mg/L 抑肽酶和100 mg/L PMSF)，提取細(xì)胞總蛋白，Bradford 法定量蛋白，各取總蛋白45 μg 經(jīng)12%SDS-PAGE 電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，分別用WT1 抗體和β-actin 抗體(Abcam)雜交，洗膜后再與生物素化的Ⅱ抗結(jié)合，DAB 顯色。采用Quantity One 軟件進(jìn)行圖像灰度分析，計(jì)算WT1 異構(gòu)體蛋白與β-actin的灰度比值以表示W(wǎng)T1 異構(gòu)體的相對(duì)表達(dá)量。

6 MTT 實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常HL-60 細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒HL-60 細(xì)胞(以下簡(jiǎn)寫為HL-60/CMV)和轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細(xì)胞(以下簡(jiǎn)寫為HL-60/WT1-/-)，以1 ×104cells/well 種植于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)對(duì)照組及加As2O3組(終濃度2 μmol/L)，分別于培養(yǎng)0、24、48、72 和96 h 每孔加入5 g/L MTT 液20 μL，在37℃、5% CO2、飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后加入DMSO 150 μL，振蕩混勻。測(cè)定各孔在570 nm 的吸光度(A570)，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，抑制率(%)=(1 -A轉(zhuǎn)染組/A對(duì)照組)×100%。

7 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

分對(duì)照組和加As2O3組(終濃度2 μmol/L)，分別于培養(yǎng)24、48 和72 h 后收集細(xì)胞，涂片后瑞特-姬姆薩染色，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

HL-60、HL-60/CMV 及HL-60/WT-/-單克隆細(xì)胞分為不加藥組和加As2O3組，分別于培養(yǎng)24、48和72 h 后收集細(xì)胞，調(diào)整其濃度為1 ×109/L。根據(jù)Annexin V-FITC/PI 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，取100 μL 細(xì)胞懸液于試管中，依次加入Annexin V-FITC 5 μL 和PI 10 μL，混勻后于室溫避光孵育30 min，在檢測(cè)管中加入PBS 400 μL，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD 法)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 重組質(zhì)粒PCDH1-WT1(17AA－ /KTS－)的鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)樣品的環(huán)狀質(zhì)粒樣條帶被酶切成2 條清晰的條帶，大小分別為7 500 bp 和1 500 bp 左右，與目的片段WT1(17AA-/KTS-)(1 493 bp)和PCDH1 質(zhì)粒(7 544 bp)的理論值大致相符，初步認(rèn)定為所需陽(yáng)性克隆構(gòu)建成功，見(jiàn)圖1。測(cè)序結(jié)果亦證實(shí)克隆出正確基因片段。

Figure 1. Identification of PCDH1-MCS1-EF1-copGFP recombinant vectors for WT1 isoforms. M:marker;1 and 2:PCR product of pCDH1;3 and 4:PCR product of pCDH1-WT1(17AA - /KTS - );3a and 4a:pCDH1-WT1(17AA - /KTS -)after enzyme digestion.圖1 WT1 異構(gòu)體插入慢病毒表達(dá)載體PCDH1-MCS1-EF1-copGFP 的PCR 和酶切鑒定

2 轉(zhuǎn)染基因mRNA 的檢測(cè)

HL-60/WT1-/-單克隆細(xì)胞中17AA-和KTS-異構(gòu)體表達(dá)均增高，17AA+異構(gòu)體比例由轉(zhuǎn)染前的0.60 ±0.04 降到轉(zhuǎn)染后的0.38 ±0.06;KTS+異構(gòu)體比例由0.53 ±0.08 降至轉(zhuǎn)染后96 h 的0.40 ±0.06，可見(jiàn)WT1 異構(gòu)體表達(dá)的比例已由17AA+/KTS+優(yōu)勢(shì)型轉(zhuǎn)變?yōu)?7AA-/KTS-優(yōu)勢(shì)型，差異顯著(P ＜0.05)。

3 轉(zhuǎn)染基因在蛋白水平的表達(dá)

Western blotting 顯示，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T1(17AA-/KTS-)異構(gòu)體的單克隆細(xì)胞中WT1 (17AA-/KTS-)蛋白表達(dá)較對(duì)照組HL-60 和HL-60/CMV 明顯增高(0.661 ±0.058 vs 0.295 ±0.070，0.661 ±0.058 vs 0.298 ± 0.025，P ＜0.05)，陽(yáng) 性 轉(zhuǎn) 染 組 WT1(17AA+/KTS+)蛋白表達(dá)較對(duì)照組HL-60 和HL-60/CMV 明顯降低(0.394 ±0.036 vs 0.498 ±0.039，0.394 ±0.036 vs 0.489 ±0.027，P ＜0.05)，而對(duì)照組HL-60 和HL-60/CMV 之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)圖2、3。

Figure 2. The expression of WT1 isoforms in HL-60 cells detected by Western blotting. 1 ～3:HL-60/WT - / -;4:HL-60;5:HL-60/CMV圖2 Western blotting 檢測(cè)HL-60 細(xì)胞中WT1 異構(gòu)體的表達(dá)

Figure 3. The relative expression of WT1 isoforms detected by Western blotting. Mean ± SD. n =3. * P ＜0.05 vs other groups.圖3 Western blotting 檢測(cè)WT1 異構(gòu)體的表達(dá)水平

4 As2O3 對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

HL60/WT1-/-組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率均明顯高于HL-60/CMV 及HL-60 組，差異顯著，進(jìn)一步提示轉(zhuǎn)染W(wǎng)T1 (17AA-/KTS-)異構(gòu)體能明顯抑制HL-60細(xì)胞的增殖，見(jiàn)表1。

表1 MTT 法測(cè)定轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組在各時(shí)點(diǎn)的抑制率Table 1. Proliferation inhibitory rates at different time points measured by MTT (%.Mean±SD. n=3)

5 形態(tài)學(xué)檢測(cè)

光鏡下可見(jiàn) HL-60、HL-60/CMV 和 HL-60/WT1-/-細(xì)胞核圓形，染色質(zhì)均勻疏松。加As2O3培養(yǎng)24 h 形態(tài)變化不明顯，處理48 h 后，各組細(xì)胞都出現(xiàn)了凋亡形態(tài)，細(xì)胞變形，胞膜完整，部分胞膜出現(xiàn)偽足樣突起，核固縮，染色質(zhì)凝聚于核周邊，處理72 h 凋亡進(jìn)一步加重;但凋亡形態(tài)改變以HL-60/WT1-/-更為明顯，見(jiàn)圖4。

Figure 4. Apoptosis of HL-60 cells shown by Wright-Giemsa staining (× 1 000). A:HL-60-cells;B:HL-60 cells treated with As2O3 for 72 h;C:HL-60/CMV cells treated with As2O3 for 72 h;D:HL-60/WT1 - / - cells treated with As2O3 for 72 h.圖4 瑞特－姬姆薩染色觀察HL-60 細(xì)胞的凋亡

6 細(xì)胞早期凋亡的變化

不加藥物的2 組均以活細(xì)胞為主，僅有少量細(xì)胞凋亡。加As2O3(2 μmol/L)24 h 后，各組細(xì)胞Annexin V+/PI-亞群均增多，而HL-60/WT1-/-組Annexin V+/PI-亞群更明顯多于HL-60/CMV 及HL-60組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見(jiàn)圖5、表2。此結(jié)果提示轉(zhuǎn)染W(wǎng)T1(17AA-/KTS-)異構(gòu)體能夠增加HL-60 細(xì)胞對(duì)As2O3的敏感性，使As2O3對(duì)HL-60細(xì)胞的促凋亡作用更加明顯。

Figure 5. Early apoptotic rates of the transfected HL-60 cells analyzed by Annexin Ⅴ/PI double staining assay. A:HL-60 cells;B:HL-60 cells treated with As2O3 for 72 h;C:HL-60/CMV cells treated with As2O3 for 72 h;D:HL-60/WT1 - / - cells treated with As2O3 for 72 h.圖5 AnnexinⅤ/PI 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡

表2 As2O3 作用不同時(shí)間各組細(xì)胞的凋亡百分率Table 2. Apoptotic rates at different time points induced by As2O3(%. Mean±SD.n=3)

討 論

WT1 為一種具有激活和抑制雙重作用的轉(zhuǎn)錄因子，參與造血細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過(guò)程的調(diào)控。近年來(lái)學(xué)者發(fā)現(xiàn)WT1 在各類白血病細(xì)胞中高表達(dá)，然而WT1 不同異構(gòu)體的存在及其功能的不同使得研究變得復(fù)雜，要真正明確WT1 在白血病中的作用及其機(jī)制尚需結(jié)合異構(gòu)體類型及比例作進(jìn)一步深入探討。

體外實(shí)驗(yàn)則表明WT1(KTS-)蛋白可通過(guò)調(diào)節(jié)一些基因如PDGFA、EGFR、PAX-2 和WT1 本身的表達(dá)而影響這些下游轉(zhuǎn)錄因子的活性及功能。有報(bào)道顯示W(wǎng)T1(17AA-)既能激活也能抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄，這取決于此基因上究竟有1 個(gè)還是2 個(gè)WT1 核蛋白的DNA 結(jié)合位點(diǎn)［4］。Richard 等［5］將WT1 的4種異構(gòu)體分別轉(zhuǎn)染至人胚腎293 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)僅17AA+異構(gòu)體能抑制紫外線照射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步顯示了17AA+異構(gòu)體在細(xì)胞凋亡中的抑制作用。Loeb 等［6］將WT1 (17AA-/KTS-)cDNA 轉(zhuǎn)染鼠源性造血祖細(xì)胞32Dcl3 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)WT1(17AA-/KTS-)可以減慢細(xì)胞增殖，加速細(xì)胞分化，且減慢細(xì)胞周期。而Inoue 等［7］同樣采用鼠源性32Dcl3 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T1(17AA+/KTS+)異構(gòu)體，發(fā)現(xiàn)WT1(17AA+/KTS+)可以抑制細(xì)胞分化，促進(jìn)細(xì)胞增殖。我們的實(shí)驗(yàn)通過(guò)將HL-60 細(xì)胞中WT1 異構(gòu)體表達(dá)的比例由17AA+/KTS+優(yōu)勢(shì)型轉(zhuǎn)變?yōu)?7AA-/KTS-優(yōu)勢(shì)型，細(xì)胞增殖受到抑制，這與Loeb 等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

目前對(duì)WT1 調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的機(jī)制存在較多爭(zhēng)論，一般認(rèn)為WT1 通過(guò)與bcl-2、c-myc 等基因相互作用，在維持細(xì)胞增殖和凋亡之間的平衡起一定的作用。bcl-2 基因在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起關(guān)鍵性作用，其第 2 外顯子存在 WT1/EGR 結(jié)合的位點(diǎn)(GCGGGGGCG)，WT1 通過(guò)調(diào)節(jié)bcl-2 的轉(zhuǎn)錄而參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控［8］。新近研究表明WT1 調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡途徑，WT1 17AA+異構(gòu)體在內(nèi)源性凋亡途徑中在線粒體上游某些位點(diǎn)起著抗凋亡作用［9-10］。Menke 等［11］將WT1 基因4 種異構(gòu)體瞬間轉(zhuǎn)染2 種肝癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)WT1(KTS-)可誘發(fā)細(xì)胞凋亡，而WT1(KTS+)則不能。我們的實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染W(wǎng)T1 (17AA-/KTS-)異構(gòu)體能夠增加HL-60 細(xì)胞對(duì)As2O3的敏感性，使As2O3對(duì)HL-60 細(xì)胞的促凋亡作用更加明顯，這與Menke 等的研究結(jié)果大致相似。

綜上，我們成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)WT1 (17AA-/KTS-)的白血病細(xì)胞株HL-60，觀察到HL-60 細(xì)胞中WT1 異構(gòu)體的優(yōu)勢(shì)型轉(zhuǎn)變?yōu)?7AA-/KTS-后細(xì)胞增殖受抑制，對(duì)As2O3誘導(dǎo)的凋亡更加敏感，具體機(jī)制及其與增殖和凋亡相關(guān)基因之間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

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