張彥萍， 田園園， 白林林， 王衛(wèi)麗， 劉 建， 李文斌， 馬麗華

(1河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸科，河北 石家莊050000;2河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，河北 石家莊050017)

特發(fā)性肺纖維化以成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積為特征［1］。越來越多的研究表明，纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)可能作為獨(dú)立的危險(xiǎn)因素參與了肺纖維化的進(jìn)程［2］。RNA 干擾技術(shù)的應(yīng)用為研究PAI-1 在肺纖維化發(fā)生中的作用提供了更加有利的手段。我們前期已經(jīng)通過組織學(xué)觀察到氣管內(nèi)滴入PAI-1 小干擾RNA (small interfering RNA，siRNA)可減輕肺組織內(nèi)膠原沉積［3］。然而，其作用機(jī)制尚不完全清楚，本研究我們從分子水平進(jìn)一步觀察PAI-1 siRNA 治療后對(duì)肺組織Ⅲ型膠原、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和金屬蛋白酶組織抑制物1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)mRNA 表達(dá)的影響，并初步探討其機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

Wistar 大鼠(河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，博萊霉素(bleomycin，BLM;天津太河制藥有限公司)，PAI-1 siRNA(廣州銳博生物科技有限公司)，PAI-1 活性測(cè)定試劑盒(Diagnostica)，RT-PCR 試劑盒(TaKaRa)，Ⅲ型膠原、α-SMA、TIMP-1 和內(nèi)參照GAPDH 的引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列見表1。

表1 RT－PCR 引物序列Table 1. Sequences of the primers for RT-PCR

2 方法

2.1 博萊霉素肺纖維化模型的建立和PAI-1 siRNA的處理 Wistar 清潔級(jí)雄性大鼠72 只，體重(140 ±20)g，采用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分成4 組，對(duì)照組(control 組)、BLM 組、BLM + 非特異siRNA 組(BLM + N 組)和BLM + PAI-1 siRNA 組(BLM + P組)，每組18 只，無水乙醚局部麻醉，仰臥位固定，常規(guī)消毒，行頸正中切口，暴露氣管，BLM 組、BLM +N組和BLM + P 組按5 mg/kg 注入生理鹽水溶解的BLM 0.2 mL，control 組注入等體積生理鹽水。造模后，每周2 次氣管內(nèi)給藥，4 周共給藥8 次，BLM +P組注入DEPC 水溶解的PAI-1 siRNA 7.5 nmol (0.2 mL);BLM+N 組注入相同劑量的非特異siRNA;control 組和BLM 組注入0.2 mL 生理鹽水。上述4 組動(dòng)物分別于第7 d、14 d 和28 d 各處死6 只，左側(cè)肺行肺泡盥洗，右中葉組織儲(chǔ)存于-80 ℃液氮中，行RT-PCR 檢測(cè)。

2.2 肺泡灌洗液中PAI-1 活性的測(cè)定 采用發(fā)色底物法測(cè)定肺泡灌洗液中PAI-1 活性，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.3 RT-PCR 法測(cè)定肺組織3 型膠原、α-SMA 和

TIMP-1 mRNA 的表達(dá) 采用一步法提取RNA。取大鼠新鮮的肺組織50 ～100 mg 放入勻漿管中，迅速加入1 mL TRIquick，冰上快速充分研磨，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清。經(jīng)加入氯仿、異丙醇、乙醇洗滌沉淀后，紫外分光光度儀對(duì)RNA 進(jìn)行定量分析，以A260與A280比值了解RNA 的純度。另取1 μL RNA 在1%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測(cè)RNA 是否完整。按照試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件:94 ℃30 s，60 ℃(Ⅲ型膠原和TIMP-1)或58 ℃(α-SMA)30 s，72 ℃30 s，與內(nèi)參照GAPDH 同管擴(kuò)增，共30 個(gè)循環(huán)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示。采用SPSS 13.0 進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，比較組間差異，有顯著差異者用最小顯著差(LSD)法進(jìn)行兩兩比較，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 每周2 次氣管內(nèi)滴注PAI-1 siRNA 持續(xù)抑制肺泡灌洗液中PAI-1 的活性

應(yīng)用博萊霉素制作肺纖維化模型后，control 組動(dòng)物身體健壯，BLM 組及非特異siRNA 組動(dòng)物萎靡不振，呼吸急促，消瘦明顯，PAI-1 siRNA 組動(dòng)物輕度呼吸困難，略有消瘦，雖然反復(fù)行氣管切開，但切口愈合良好，組織粘連不明顯。在我們最近發(fā)表的論文中，通過組織學(xué)觀察也證實(shí)博萊霉素肺纖維化模型制作成功［3］。

造模成功后，我們觀察到模型組7 d、14 d 和28 d 肺泡灌洗液中PAI-1 活性升高，與control 組比較有明顯差異，并且存在時(shí)間依賴性。每周2 次氣管內(nèi)注入PAI-1 siRNA 后，BLM +P 組灌洗液中PAI-1 活性明顯減低，與同一時(shí)點(diǎn)BLM 組有明顯差異(均P ＜0.05)，BLM 組與BLM +N 組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明非特異性siRNA沒有治療效果，見圖1。

Figure 1. The activity of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1)in bronchoalveolar lavage fluid on day 7，14，and 28 after intratracheal injection or PAI-1 siRNA in bleomycin(BLM)-induced rat lung tissues. Mean ±SD.n=6. * P ＜0.05 vs control;△P ＜0.05 vs BLM.圖1 氣管內(nèi)滴入PAI-1 siRNA 7 d、14 d 和28 d 支氣管肺泡灌洗液中PAI-1 活性的變化

2 PAI-1 siRNA 抑制肺組織Ⅲ型膠原的合成和α-SMA 的表達(dá)

由圖2、3 可見，氣管內(nèi)滴入博來霉素7 d、14 d和28 d 后，BLM 組動(dòng)物肺組織Ⅲ型膠原及α-SMA 表達(dá)明顯升高，與control 組比較有明顯差異，BLM 組與BLM+N 組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每周2 次氣管內(nèi)注入PAI-1 siRNA 后，3 個(gè)時(shí)點(diǎn)BLM +P 組動(dòng)物肺組織Ⅲ型膠原及α-SMA 表達(dá)均明顯減少，與同一時(shí)點(diǎn)BLM 組比較有明顯差異(均P ＜0.05)。

3 PAI-1 siRNA 抑制肺組織TIMP-1 的表達(dá)

圖4 顯示，在7 d、14 d、28 d，博來霉素誘導(dǎo)模型組動(dòng)物肺組織TIMP-1 表達(dá)增加，BLM +P 組動(dòng)物肺組織TIMP-1 的表達(dá)較同一時(shí)點(diǎn)BLM 組比較明顯減低(均P ＜0.05)。

Figure 2. The expression of collagen type Ⅲon day 7 (A)，14 (B)and 28 (C)after intratracheal injection of PAI-1 siRNA in BLMinduced rat lung tissues. M:marker. Mean±SD. n=6. * P ＜0.05 vs control;△P ＜0.05 vs BLM.圖2 氣管內(nèi)滴入PAI-1 siRNA 7 d、14 d 和28 d 對(duì)肺組織Ⅲ型膠原表達(dá)的影響

Figure 3. The expression of α-smooth muscle (α-SMA)actin on day 7 (A)，14 (B)and 28 (C)after intratracheal injection PAI-1 of siRNA in BLM-induced rat lung tissues. M:marker. Mean ± SD. n =6. * P ＜0.05 vs control;△P ＜0.05 vs BLM.圖3 氣管內(nèi)滴入PAI-1 siRNA 7 d、14 d 和28 d 對(duì)肺組織α-SMA 表達(dá)的影響

討 論

雖然RNA 干擾(RNAi)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中成功應(yīng)用僅有10 余年，但已經(jīng)成為基因功能研究及基因治療的全新手段［4］。由于核酸酶的影響，siRNA 在動(dòng)物體內(nèi)不穩(wěn)定，因此，如何將siRNA 遞送到動(dòng)物體內(nèi)已經(jīng)成為RNAi 面臨的主要問題。對(duì)SARS 病毒、支氣管哮喘等模型的研究表明，鼻腔或氣管局部給藥可以在肺部產(chǎn)生顯著的靶向基因沉默［5-7］，但是這些模型大多在3 ～5 d，對(duì)肺纖維化這樣需要至少28 d 的長(zhǎng)時(shí)間模型，如何減少核酸酶的影響還少有研究。為了產(chǎn)生最大的沉默效果，我們首先進(jìn)行了細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)，觀察到PAI-1 促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成［8］，PAI-1 siRNA 對(duì)肺成纖維細(xì)胞的沉默效率在70%左右［9］，然后我們將siRNA 進(jìn)行甲基化修飾，以增加siRNA 的穩(wěn)定性，局麻下采用每周2 次氣管內(nèi)滴入的方式，將藥物直接注入大鼠肺組織，4周內(nèi)共給藥8 次。我們觀察到PAI-1 siRNA 組動(dòng)物精神萎靡不明顯，輕度呼吸困難，切口愈合良好，局部黏連較輕，操作時(shí)易于分離。同時(shí)，我們觀察到模型組肺泡灌洗液中PAI-1 活性隨著時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)增加，說明肺纖維化過程中纖溶活性持續(xù)受損。滴入siRNA 后，7 d、14 d 和28 d 灌洗液中PAI-1 的活性明顯減低，說明我們的方法可以成功沉默PAI-1 基因，減少肺組織PAI-1 的表達(dá)。

Figure 4. The expression of TIMP-1 on day 7 (A)，14 (B)and 28 (C)after intratracheal injection of PAI-1 siRNA in BLM-induced rat lung tissues. M:marker.Mean±SD. n=6. * P ＜0.05 vs control;△P ＜0.05 vs BLM.圖4 氣管內(nèi)滴入PAI-1 siRNA 7 d、14 d 和28 d 對(duì)肺組織TIMP-1 表達(dá)的影響

成功地沉默了PAI-1 基因后，我們進(jìn)一步觀察了PAI-1 siRNA 對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的纖維化肺組織膠原沉積及成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響。我們知道，α-SMA是肌成纖維細(xì)胞特有的標(biāo)志，α-SMA 表達(dá)增加表明成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，從而合成更多的膠原纖維。研究表明，肺纖維化程度與α-SMA 的水平有關(guān)［10］。我們通過PCR的方法觀察到氣管內(nèi)滴入博萊霉素后，肺組織Ⅲ型膠原及α-SMA表達(dá)明顯升高，誘導(dǎo)肺纖維化發(fā)生。每周2 次氣管內(nèi)滴入PAI-1 siRNA 可以使纖維化的肺組織Ⅲ型膠原及α-SMA表達(dá)減少。我們最近通過組織學(xué)和免疫組化研究也觀察到氣管內(nèi)滴入PAI-1 siRNA 減少纖維化肺組織膠原沉積［3］，在細(xì)胞水平，我們也觀察到PAI-1 對(duì)成纖維細(xì)胞的直接作用［10］。我們認(rèn)為，降低PAI-1 的表達(dá)可以抑制成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，抑制膠原合成，從而抑制肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展。PAI-1 可能作為肺纖維化治療的新靶點(diǎn)。

我們進(jìn)一步探討了PAI-1 siRNA 抑制肺纖維化的機(jī)制。近年來研究表明，PAI-1 在細(xì)胞增殖、凋亡、腫瘤血管的發(fā)生、促進(jìn)動(dòng)脈硬化及器官纖維化中發(fā)揮重要作用［11-12］，已有嘗試應(yīng)用PAI-1 siRNA 治療肝纖維化的報(bào)道［13］。但是機(jī)制還不清楚。我們知道，PAI-1 的生理作用是抑制尿激酶型纖溶酶原激活劑和組織型纖溶酶原激活劑，進(jìn)而抑制纖溶酶的活性。纖溶酶能夠降解膠原纖維已是不爭(zhēng)的事實(shí)，更有近來Horowitz 等［14］和Bauman 等［15］認(rèn)為纖溶酶活化可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡和前列腺素E2的合成。本研究中我們沒有從傳統(tǒng)觀念觀察PAI-1 對(duì)纖溶酶的影響，而是觀察PAI-1 siRNA 對(duì)肺組織膠原產(chǎn)生的直接作用和對(duì)TIMP-1 表達(dá)的影響。我們知道，基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制物的平衡在肺纖維化的發(fā)生中起重要作用，過度表達(dá)TIMP-1 可以使細(xì)胞外基質(zhì)合成過剩，沉積于肺間質(zhì)，導(dǎo)致肺纖維化，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到氣管內(nèi)滴入PAI-1 siRNA 可以使纖維化的肺組織中TIMP-1 表達(dá)減少，同時(shí)伴隨有肺纖維化的減輕，因此我們認(rèn)為，PAI-1 siRNA 可能是通過打破基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制物的平衡發(fā)揮作用的。

總之，通過本實(shí)驗(yàn)我們觀察到，每周2 次氣管內(nèi)注入PAI-1 siRNA 可以使支氣管肺泡灌洗液PAI-1表達(dá)持續(xù)減低，并且抑制肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展，在此過程中，伴隨有基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制物的失衡。PAI-1 有望成為肺纖維化治療的新靶點(diǎn)。

［1］ Doubková M，Skhicková J. Idiopathic pulmonary fibrosis［J］. Vnitr Lek，2005，51(12):1375-1384.

［2］ Chuang-Tsai S，Sisson TH，Hattori N，et al. Reduction in fibrotic tissue formation in mice genetically deficient in plasminogen activator inhibitor-1［J］. Am J Pathol，2003，163(2):445-452.

［3］ Zhang YP，Li WB，Wang WL，et al. siRNA against plasminogen activator inhibitor-1 ameliorates bleomycin-induced lung fibrosis in rats［J］. Acta Pharmacol Sin，2012，33(7):897-908.

［4］ Castanotto D，Rossi1 JJ. The promises and pitfalls of RNA interference-based therapeutics［J］. Nature，2009，457(7228):426-433.

［5］ Durcan N，Murphy C，Cryan SA. Inhalable siRNA:potential as a therapeutic agent in the lungs［J］. Mol Pharm，2008，5(4):559-566.

［6］ Miyamoto S，Hattori N，Senoo T，et al. Intra-airway administration of small interfering RNA targeting plasminogen activator inhibitor-1 attenuates allergic asthma in mice［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2011，301(6):L908-L916.

［7］ Cao YL，Wang Y，Guo R，et al. Identification and characterization of three novel small interference RNAs that effectively down-regulate the isolated nucleocapsid gene expression of SARS coronavirus［J］. Molecules，2011，16(2):1544-1558.

［8］ 張彥萍，王衛(wèi)麗，劉 建，等. 纖維溶解酶原激活物抑制劑-1 對(duì)大鼠胚肺成纖維細(xì)胞的影響［J］. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2011，34(7):500-503.

［9］ Zhang YP，Wang WL，Liu J，et al. Plasminogen activator inhibitor-1 promotes the proliferation and inhibits the apoptosis of pulmonary fibroblasts by Ca2+signaling［J］.Thromb Res，2012，131(1):64-71.

［10］李佳鑫，海廣范，賈巖龍，等.全反式維甲酸對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖及α-SMA 表達(dá)的影響［J］. 中國(guó)病理生理雜志，2011，27(4):787-790.

［11］ Balsara RD，Ploplis VA. Plasminogen activator inhibitor-1:the doubleedged sword in apoptosis［J］. Thromb Haemost，2008，100(6):1029-1036.

［12］ Lademann UA，R?mer MU. Regulation of programmed cell death by plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1)［J］. Thromb Haemost，2008，100(6):1041-1046.

［13］Hu PF，Chen H，Zhong W，et al. Adenovirus-mediated transfer of siRNA against PAI-1 mRNA ameliorates hepatic fibrosis in rats［J］. J Hepatol，2009，51(1):102-113.

［14］Horowitz JC，Rogers DS，Simon RH，et al. Plasminogen activation induced pericellular fibronectin proteolysis promotes fibroblast apoptosis［J］. Am J Respir Cell Mol Biol，2008，38(1):78-87.

［15］Bauman KA，Wettlaufer SH，Okunishi K，et al. The antifibrotic effects of plasminogen activation occur via prostaglandin E2synthesis in humans and mice［J］. J Clin Invest，2010，120 (6):1950-1960.