王建軍， 楊秀紅， 王銀環(huán)， 劉英超， 王小君， 張 田， 孫 娜， 張連元

(河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，河北 唐山063000)

急性腎損傷是臨床上休克后常見的并發(fā)癥，其機(jī)制不詳。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，止血帶休克(tourniquet shock，TS)后小鼠腎組織血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)表達(dá)上調(diào)和ACE2 表達(dá)下調(diào)，同時(shí)TS 小鼠出現(xiàn)腎氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)、腎功能損傷變化［1］。ACE 可催化血管緊張素Ⅰ(angiotensinⅠ，AngⅠ)生成AngⅡ，而ACE2 作為腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)的負(fù)調(diào)控分子可將AngⅡ降解為Ang(1-7)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，ACE2 能夠預(yù)防AngⅡ介導(dǎo)的腎氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化作用［2］。因此我們?cè)O(shè)想，ACE2 基因敲除(ACE2 KO)可能通過(guò)增加腎ACE/AngⅡ表達(dá)促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)氧化應(yīng)激機(jī)制而加重器官損傷。為此在本實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用ACE2 KO 小鼠制作TS 模型，觀察ACE2 KO 小鼠在TS 后腎組織ACE/AngⅡ表達(dá)變化以及腎損傷的反應(yīng)，旨在進(jìn)一步探討ACE2 在休克后急性腎損傷中的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 主要試劑 蛋白提取試劑盒、蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Western blotting 蛋白marker、X 線片ECL 發(fā)光劑、定影劑和顯影劑均為碧云天試劑公司產(chǎn)品;ACE、ACE2 和β-actin 抗體均購(gòu)自Abcam;AngⅡ酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定ELISA 試劑盒購(gòu)自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司;丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和肌酐(creatinine，Cr)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 動(dòng)物 6 月齡雄性野生型和ACE2 基因敲除C57BL/6 小鼠由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所引進(jìn)，于河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。

2 方法

按照蛋白提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。將一側(cè)腎組織100 mg 放入玻璃勻漿器，加入1 mL 蛋白裂解液勻漿，12 000 r/min 離心5 min，留取上清。用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，用裂解液將各蛋白配成濃度為6 g/L，取10 μL 蛋白樣品與5 ×上樣緩沖液混勻，煮沸5 min 后SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜3 ～5 h，5%BSA 室溫封閉1 h，I 抗孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次5 min，Ⅱ抗孵育0.5 h，TBST 洗膜3 次，每次5 min。ECL 發(fā)光試劑均勻鋪于膜上孵育2 min，曝光后，顯影、定影。結(jié)果用ImageJ 圖像分析軟件進(jìn)行分析。

2.4 ELISA 測(cè)定腎組織AngⅡ水平 將100 mg 腎組織放入玻璃勻漿器，加入5 mL PBS 研磨，12 000 r/min離心5 min，留取上清。應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)抑制酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定樣本中AngⅡ水平。簡(jiǎn)單地說(shuō)，往已包被鼠AngⅡ單克隆抗體的微孔中同時(shí)加入生物素標(biāo)記的抗原和待測(cè)樣品50 μL，37 ℃溫育1 h。洗滌3次，然后加入HRP 標(biāo)記的親和素，37 ℃溫育30 min。洗滌5 次，加入90 μL 底物TMB 顯色15 min。加終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，同時(shí)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度。

2.5 SOD 活性和MDA 含量測(cè)定 取腎組織100 mg，用RIPA 裂解液制成10%組織勻漿，離心、提取上清。硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)組織MDA，結(jié)果以μmol/g 蛋白表示;氮藍(lán)四唑(NBT)法測(cè)組織SOD 活性，結(jié)果以103U/g 蛋白表示。按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀分別在535 nm 和550 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

2.6 BUN 和血清Cr 的測(cè)定 待全血凝固后，3 000 r/min 離心5 min 取上清。二乙酰-肟比色法測(cè)定BUN 含量，結(jié)果以mmol/L 表示;苦味酸法測(cè)定血清Cr，結(jié)果以μmol/L 表示。按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀分別在640 nm 和510 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

2.1 模型復(fù)制 采用我室常規(guī)復(fù)制小鼠TS 模型，水合氯醛按3 mL/kg 腹腔注射麻醉小鼠，用橡皮帶環(huán)繞結(jié)扎小鼠雙后肢根部，阻斷血流2 h 后松開橡皮帶使血流再灌注，于4 h 摘眼球放血處死小鼠，取血漿和腎組織，-70 ℃冰箱保存待各指標(biāo)測(cè)定。

2.2 動(dòng)物分組 將2 種小鼠分別隨機(jī)分為(1)野生型小鼠(WT)組，不進(jìn)行結(jié)扎處理;(2)野生型止血帶休克(WT+TS)組，結(jié)扎止血帶;(3)ACE2 基因敲除(KO)組，不進(jìn)行結(jié)扎處理;(4)ACE2 基因敲除止血帶休克(KO+TS)組，結(jié)扎止血帶。每組6 只動(dòng)物。

2.3 Western blotting 測(cè)定腎組織ACE 蛋白表達(dá)

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析。統(tǒng)計(jì)處理均由SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。

結(jié) 果

1 腎組織ACE 表達(dá)的變化

Western blotting 顯示，與WT 小鼠相比，WT +TS小鼠腎組織ACE 表達(dá)明顯增加;KO 小鼠在肢體缺血再灌注后ACE 表達(dá)進(jìn)一步增加，明顯高于WT 小鼠;與WT+TS 小鼠比較，KO +TS 小鼠腎組織ACE表達(dá)也顯著增加，見圖1。

Figure 1. ACE expression in mouse kidneys of each group. Mean±SD. n=6. ##P ＜0.01 vs WT group;* P ＜0.05 vs WT+TS group.圖1 各組小鼠腎組織ACE 的表達(dá)

2 腎組織AngⅡ水平的變化

ELISA 結(jié)果顯示，與WT 小鼠相比，WT +TS 小鼠腎組織AngⅡ水平水平明顯增加;KO 小鼠在肢體缺血再灌注后Ang Ⅱ水平進(jìn)一步增加，明顯高于WT小鼠;與WT + TS 小鼠比較，KO + TS 小鼠腎組織AngⅡ水平也顯著增加，見圖2。

Figure 2. AngⅡlevel in mouse kidneys of each group. Mean±SD. n=6. #P ＜0.05，##P ＜0.01 vs WT group;* P＜0.05 vs WT+TS group.圖2 各組小鼠腎組織AngⅡ的水平

3 MDA 含量和SOD 活性測(cè)定結(jié)果

化學(xué)比色結(jié)果顯示，與WT 小鼠相比，WT + TS小鼠腎組織MDA 含量明顯增加;KO 小鼠腎組織MDA 含量未見明顯增加，但在KO +TS 小鼠明顯高于WT+TS 小鼠，見圖3。與WT 小鼠相比，WT +TS小鼠腎組織SOD 活性明顯降低;KO 小鼠腎組織SOD 活性無(wú)明顯下降，但在KO + TS 小鼠腎組織SOD 活性明顯低于WT+TS 小鼠，見圖3。

Figure 3. MDA content (A)and SOD activity (B)in kidneys of mice. Mean ± SD. n =6. ##P ＜0.01 vs WT group;* P ＜0.05 vs WT+TS group.圖3 各組小鼠腎組織MDA 含量和SOD 活性

4 BUN 和血清Cr 測(cè)定結(jié)果

化學(xué)比色結(jié)果顯示，WT +TS 小鼠BUN 和血清Cr 含量較WT 小鼠明顯增加;與WT 小鼠相比，KO小鼠BUN 和血清Cr 含量無(wú)明顯增加，但在KO +TS小鼠BUN 和血清Cr 含量均明顯高于WT+TS 小鼠，見圖4。

討 論

早在幾十年前人們就發(fā)現(xiàn)不同種類的休克與RAS 系統(tǒng)的激活有關(guān)，它是保證重要器官如心臟、腦等血供的一種代償性反應(yīng)。然而嚴(yán)重休克時(shí)RAS 系統(tǒng)不適當(dāng)?shù)募せ顚?duì)某些器官不僅不能發(fā)揮保護(hù)作用，而且還可能加重器官損傷。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［3-4］，休克時(shí)局部器官如肺臟ACE 表達(dá)增加，ACE 增加能提高血清AngⅡ的水平，過(guò)量的AngⅡ通過(guò)增加氧自由基的釋放加重器官損傷。盡管幾十種ACE 抑制劑和血管緊張素受體阻斷劑挽救和延長(zhǎng)了許多心血管患者的生命，但在休克患者和動(dòng)物的應(yīng)用效果報(bào)道不一［5-6］。

Figure 4. Content of BUN (A)and serum Cr (B)in mice of each group. Mean ± SD. n = 6. ##P ＜0.01 vs WT group;* P ＜0.05 vs WT+TS group.圖4 各組小鼠TS 前后BUN 和血清Cr 的含量

目前認(rèn)為RAS 還存在另外一條ACE2 催化的舒血管通路［7］，2 條通路相互拮抗、相互調(diào)節(jié)，循環(huán)RAS主要發(fā)揮調(diào)節(jié)血壓、維持水電平衡作用，而局部RAS在組織損傷修復(fù)中發(fā)揮主要作用。研究發(fā)現(xiàn)，具有抗炎作用的活性蛋白C 通過(guò)降低腎ACE 和提高腎ACE2 的表達(dá)減輕LPS 誘導(dǎo)的腎損傷［8］;血管緊張素1 型(angiotensin type 1 receptor，AT1)受體阻斷劑也可以通過(guò)抑制ACE2 的降低改善內(nèi)毒素休克誘導(dǎo)的肺損傷［9］。這些資料表明，休克的發(fā)生不僅出現(xiàn)ACE 表達(dá)變化，而且負(fù)調(diào)控分子ACE2 表達(dá)變化也參與了休克的發(fā)生。

ACE 可催化AngⅠ生成AngⅡ，而ACE2 可將AngⅡ降解為Ang(1-7)。但在RAS 復(fù)雜的反應(yīng)通路中，還存在其它催化途徑。ACE2 不僅能降解AngⅡ，還能將AngⅠ轉(zhuǎn)化成Ang(1-9);糜蛋白酶、組織蛋白酶A 也可以催化AngⅠ生成AngⅡ;除了ACE2，其它脯氨酰內(nèi)肽酶、脯氨酰羧肽酶也將AngⅡ降解為Ang(1-7)［10］。因此，組織AngⅡ水平可能受多種酶催化反應(yīng)的影響。我們研究發(fā)現(xiàn)，小鼠TS 后，腎組織ACE 表達(dá)增加，小鼠TS 后AngⅡ水平明顯上升;ACE2 KO 小鼠TS 前AngⅡ水平增加，TS 后AngⅡ水平進(jìn)一步增加，明顯高于WT +TS 小鼠AngⅡ水平。這些結(jié)果表明，TS 時(shí)腎組織ACE 表達(dá)增加是引起AngⅡ升高的主要原因，而ACE2 基因的缺失通過(guò)降低AngⅡ分解進(jìn)一步提高AngⅡ，從而影響休克的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程。

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，休克后多器官損傷的發(fā)生是全身炎癥反應(yīng)累及局部器官所致。止血帶休克時(shí)大量的活性氧代謝產(chǎn)物從局部缺血組織釋放，激活了一些內(nèi)源性的炎癥介質(zhì)如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)等，炎癥失控導(dǎo)致多器官氧化應(yīng)激損傷［11］。文獻(xiàn)報(bào)道，AngⅡ的輸注可明顯提高腎組織TNF-α 等炎癥介質(zhì)的表達(dá)，而給予ACE 抑制劑可使TNF-α 的過(guò)表達(dá)消失［12］;ACE2 可以抑制AngⅡ升高引起的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)［2］;ACE2 缺失促進(jìn)糖尿病小鼠腎的氧化應(yīng)激損傷，并與ACE 表達(dá)上調(diào)有關(guān)［13］;高血壓腎病的患者AngⅡ可通過(guò)AT1受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制上調(diào)ACE 并下調(diào)ACE2 的表達(dá)［14］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，ACE2 基因敲除上調(diào)了小鼠ACE/AngⅡ的表達(dá)，但尚不足以引起腎的氧化應(yīng)激損傷，而休克后的ACE2 基因敲除小鼠由于大量AngⅡ的產(chǎn)生，加重了腎的氧化應(yīng)激反應(yīng)和功能損傷。根據(jù)文獻(xiàn)和我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表明，ACE 與ACE2 是休克誘導(dǎo)腎損傷中一對(duì)作用相反的重要調(diào)節(jié)因子。

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