劉姍姍， 岳素文， 江 洪， 王成彬， 呂建新△

1溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院，生命科學(xué)學(xué)院，溫州325000

2北京泰格瑞分子檢驗有限公司，北京102209

3中國人民解放軍總醫(yī)院臨床檢驗科，北京100853

實時熒光定量PCR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于基因定量、DNA甲基化分析、線粒體基因損傷的定量分析、疾病相關(guān)microRNA、病原微生物檢測等相關(guān)領(lǐng)域［1－2］。以SYBR GreenⅠ為代表的熒光染料法高效、經(jīng)濟、準確、重復(fù)性好、無需另外設(shè)計探針［3－4］，但由于染料可非特異性結(jié)合到雙鏈DNA小溝上，導(dǎo)致引物二聚體和非目的DNA的擴增使結(jié)果的判斷更加困難，尤其是對低濃度的樣本進行精確定量時，很難分辨是否為非特異性擴增引起的假陽性結(jié)果，因此限制了該技術(shù)的應(yīng)用［5］。本研究通過SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR對無模板引物對測試結(jié)果分析，闡明一種新的引物二聚體形成的機制，探討SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR的優(yōu)化方案并測試定量檢測乙肝病毒的效果。

1 材料與方法

1．1 試劑和儀器

6mmol／L dNTPs（U 替換 T），5U／μL Taq DNA酶，25×SYBR GreenⅠ，10×PCR buffer（10 mmol／L Tris pH 8．3，50mmol／L KCl，2．0mmol／L MgCl2，20%葡聚糖，PCR增效劑，特異性反義核苷酸，短寡核苷酸序列、引物對，dH2O，SYBR GreenⅠ實時熒光定量檢測乙肝病毒試劑盒（批號：20120426）。以上材料均由北京泰格瑞分子檢驗有限公司提供。TL988Real－time PCR儀購買自西安天隆科技有限公司。

1．2 寡核苷酸序列設(shè)計

以GenBank中搜索的若干基因序列為模板，利用軟件 DNAMAN、Prime Primer 5設(shè)計符合本實驗要求的引物對，引物序列均為17～23b，Tm值為54℃～60℃。引物對 A／a、B／b、C／c的3′末端存在6堿基（下劃線部分）連續(xù)反向互補，引物對D／d、E／e、F／f是一條引物的3′末端與另一引物的中間存在連續(xù)6個堿基（下劃線部分）反向互補。G／g、H／h、I／i為一條引物的3′末端有6個堿基（下劃線部分）與另一條引物的5′末端連續(xù)反向互補。J／j、K／k、L／l是利用軟件設(shè)計的普通引物對。M／m、N／n、O／o為滿足一般的引物設(shè)計要求且中間部分堿基同向相同的引物對，分別能夠擴增布魯菌、多重腸道病毒、乙肝病毒的DNA序列。其中O是在序列中間人為地修改了1個堿基后的引物，修改后使得O／o存在7堿基（斜體部分）同向相同，但是3′末端仍可以與模板完全結(jié)合，不影響靶特異性。針對該引物對設(shè)計了特異性反義核酸，其序列都與O引物中間部分的堿基同向互補。P來自乙肝病毒DNA的X區(qū)，p是與P 100%反向相同的寡核苷酸序列。R和S為人工設(shè)計的短寡核苷酸序列，其3′末端分別與O和o的3′末端連續(xù)4堿基反向互補，檢測其對引物二聚體形成的影響。本文用到的寡核苷酸的序列和來源見表1。

表1 引物和寡核苷酸序列Table 1 Primers and oligonucleotide sequences

1．3 無模板SYBR GreenⅠReal－time PCR

定量引物二聚體反應(yīng)體系：25μL SYBR GreenⅠPCR 反應(yīng)體系：引物 F／R（5μmol／L）0．5μL，dNTP（10mmol／L，U 替 T）0．5μL，SYBR GreenⅠ （25×）1．0μL，Taq酶（5U／μL）1．0μL，10×PCR buffer 2．5μL，以dH2O 將反應(yīng)體積補足到25 μL。每PCR管沿上部管壁小心地加30μL礦物油?？焖匐x心、不混勻。陰性對照以dH2O代替反應(yīng)中的引物對，其余操作相同。檢測R、S對引物二聚體（PD，primer－dimmer）形成是否有促進作用時用20%葡聚糖稀釋R、S及R＋S到3個不同的濃度：20 μmol／L、2μmol／L、0．2μmol／L，分別加入各反應(yīng)管中以觀察在熱循環(huán)反應(yīng)中對PD形成的影響。

將此3支反應(yīng)管手動進行以下5個循環(huán)的處理：95℃熱水浴60s，4℃冰箱15min，室溫下15 min。然后分別取25μL反應(yīng)管1、2、3中的反應(yīng)混合物（下層液體）作為最終的測試混合物在重新加入30μL礦物油封閉后進行測試。熒光定量反應(yīng)條件與其他測試的反應(yīng)條件相同。

SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2min后進行如下45個循環(huán)的反應(yīng)：95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，在延伸過程中收集熒光信號（激發(fā)波492nm，檢測波518 nm）（根據(jù)具體實驗需求可以適當增加循環(huán)數(shù)）。

1．4 SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR乙肝病毒試劑盒標準曲線測試

按照試劑盒說明書的操作步驟以同一試劑盒中的質(zhì)粒標準品為模板，分別以部分同向相同的引物對O／o和普通引物對L／l為引物對測試標準曲線。

2 結(jié)果

2．1 促進引物二聚體形成

3′末端連續(xù)6堿基反向互補的引物對、一條引物3′端結(jié)合到另一條引物的中部或者5′端而不能相互反向結(jié)合的引物對測試的Ct值見表2。當一條引物的3′端結(jié)合到另一條引物的5′端時測試的Ct值有的＞45．0，整體上沒有規(guī)律性，此處僅以其中3對為代表進行測試。相應(yīng)的PCR擴增曲線見圖1。

表2 6堿基反向互補引物對測試Table 2 Ct values of 6－base reverses complementary primers

圖1 6堿基反向互補引物對測試PCR擴增曲線Fig．1 The PCR amplification curves of 6－base reverses complementary primers

2．2 短寡核苷酸序列的橋接作用

在含有引物對O／o的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR反應(yīng)體系中分別加入不同濃度熱啟動短寡核苷酸，在50℃退火溫度的條件下不能促進引物二聚體形成，但是有干擾作用。經(jīng)過低溫處理后的短寡核苷酸在相同反應(yīng)條件下促進引物二聚體的形成。定量結(jié)果Ct值見表3。說明在一般的熒光定量PCR反應(yīng)條件下僅僅有3′末端反向互補結(jié)合是不足以形成引物二聚體的，還需要借助于其他的外力才能形成引物二聚體。同時說明在普通的PCR熱循環(huán)反應(yīng)中引物不是依靠每個循環(huán)延伸1～2b直到能有3′末端的牢固結(jié)合后形成引物二聚體。

2．3 普通、100%同向相同、部分同向相同、100%反向相同引物對測試

100%同向相同的引物對（A／A）在無模板測試中，45個循環(huán)內(nèi)未形成PCR擴增曲線，普通、部分（5～7b）同向相同、100%反向相同的引物對均形成指數(shù)擴增曲線（圖2），Ct值見表4，說明完全同向相同的引物對能夠抑制引物二聚體，部分同向相同的一對引物能夠部分抑制引物二聚體，100%反向相同和普通引物對易于形成引物二聚體。連續(xù)同向相同的堿基在引物對序列的3′或5′末端不影響引物二聚體的Ct值，在設(shè)計部分同向相同的引物對時應(yīng)當將連續(xù)相同的堿基置于引物對的中間，距離3′末端4～5b，并且結(jié)合實際情況應(yīng)保證相同的部分為5～8b。

表3 低溫預(yù)處理后短寡核苷酸加入后測試Ct值Table 3 The Ct value of the mixture containing short oligonucleotides pretreated with low temperature

表4 不同引物對測試結(jié)果Table 4 The detection results of different pairs

圖2 不同引物對測試PCR擴增曲線Fig．2 The PCR amplification curves of different pairs of primers

2．4 寡核苷酸序列間同向互補作用測試

引物對O／o在SYBR GreenⅠ熒光定量PCR測試結(jié)果Ct值為39，在相同反應(yīng)條件下在反應(yīng)體系中加入與O同向互補的反義核酸Q的測試結(jié)果是在60個熱循環(huán)反應(yīng)中未檢測到引物二聚體。每個試驗管做3次重復(fù)的PCR擴增結(jié)果見圖3。能夠同向互補結(jié)合到上游引物中部的反義核酸的長度是9b，優(yōu)化效果與6～7b長的與上游引物反向互補的反義核酸的優(yōu)化效果相當，若短于9b則無明顯優(yōu)化效果。

2．5 PCR增效劑對普通、部分同向相同的引物對的優(yōu)化效果

普通引物L／l在聯(lián)合應(yīng)用PCR增效劑時僅僅能夠推后1個Ct值，但是在部分同向相同的引物對O／o（7個堿基相同）聯(lián)用PCR增效劑時可以推后10個Ct值，PCR擴增曲線見圖4。圖4顯示PCR增效劑的作用在部分同向相同的引物對基礎(chǔ)上效果更好，證明引物設(shè)計是非特異性控制的關(guān)鍵。

圖3 同向互補的反義核酸對引物對O／o的優(yōu)化效果Fig．3 The optimized effect of synthetic complementary antisense nucleic acid primers on O／o

圖4 PCR增效劑的優(yōu)化效果Fig．4 PCR enhancer optimization

2．6 SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測乙肝病毒

試劑盒標準曲線測試結(jié)果見圖5，普通引物對L／l檢測時出現(xiàn)假陽性（圖5A），含有同向相同序列的引物對O／o測試的標準曲線在檢測低濃度樣本時更佳（圖5B）。

圖5 乙肝病毒試劑盒標準曲線對比Fig．5 Contrast of standard curves

3 討論

實時熒光定量PCR中非特異性擴增的形成原因分為外部因素和內(nèi)部因素。外部因素主要為氣霧膠的污染，即PCR反應(yīng)過程中，擴增的目的片段在熱循環(huán)反應(yīng)中進入空氣中形成氣霧膠，使得下一次的PCR反應(yīng)在前面氣霧膠污染的基礎(chǔ)上進行而不能避免非特異性擴增。目前減少氣霧膠污染的方法很多，例如采用礦物油封閉反應(yīng)體系、用dUTP替換dTTP聯(lián)合UDG酶等方法。內(nèi)部因素包括PCR熱循環(huán)反應(yīng)之前反應(yīng)體系中聚合酶的低溫擴增作用、引物的非特異性擴增及引物二聚體的形成。針對內(nèi)部因素干擾的問題已有人提出了多種優(yōu)化方案，例如熱啟動、修飾DNA聚合酶、使用PCR增強劑等，但效果都不理想，特別是引物二聚體的產(chǎn)生對PCR結(jié)果定量分析的影響顯著。

根據(jù)文獻報道，PCR反應(yīng)中引物二聚體的形成必須有Taq DNA聚合酶、一對上下游引物、脫氧核苷酸［6］，在此基礎(chǔ)上利用SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR無模板測試技術(shù)來進一步在分子水平上研究引物二聚體的形成機制。通過測試有典型特點的引物對，發(fā)現(xiàn)3′端連續(xù)6堿基反向互補促進引物二聚體的形成，而當一條引物的3′端堿基不能與另一引物的3′端堿基配對結(jié)合時不影響或抑制引物二聚體形成，說明3′端的堿基連續(xù)反向互補是形成引物二聚體的一個必要條件。

能夠反向互補結(jié)合到引物序列的3′末端的短寡核苷酸在高溫熱循環(huán)PCR反應(yīng)中不能夠作為上下游引物之間的橋梁促進引物二聚體的形成，而預(yù)先經(jīng)過低溫循環(huán)處理的反應(yīng)體系在相同條件下促進引物二聚體的形成，說明在低溫循環(huán)反應(yīng)中短寡核苷酸既能反向互補結(jié)合到引物的3′末端，也能在聚合酶的作用下利用反應(yīng)體系中的原料進行延伸反應(yīng)，但在高溫熱循環(huán)反應(yīng)中能夠反向結(jié)合到引物序列的3′末端，不能進行延伸反應(yīng)。這一結(jié)果提示PCR熱循環(huán)反應(yīng)中引物二聚體的形成需要在3′末端反向互補的基礎(chǔ)上借助其他力量。

從2．3測試結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，部分或全部同向相同的引物對可抑制引物二聚體的形成，此結(jié)果說明除3′末端的堿基外的序列同向相同可以抑制引物二聚體形成，即按照一般的引物設(shè)計原則得到的引物無法避免3′末端相互間1～2個堿基的反向互補，即可在反向互補的基礎(chǔ)上借助余下的序列在同方向上形成的相互作用力結(jié)合在一起而延伸形成引物二聚體。這一機制說明引物序列同方向上堿基之間的排斥使得引物對在空間上無法生成引物二聚體的過渡態(tài)，從而無法在反應(yīng)體系中累積。根據(jù)已有的引物設(shè)計原則設(shè)計的普通引物對可以避免3′端多堿基連續(xù)反向互補，但是無法避免1～2個堿基反向互補結(jié)合，在此基礎(chǔ)上借助余下序列的同向互補結(jié)合力量就可以形成引物二聚體。

據(jù)文獻報道，引物二聚體在PCR反應(yīng)中存在多種形成機制，且各種機制之間在熱循環(huán)反應(yīng)的不斷進行中相互影響，但目前尚未闡明具體機制。以上的實驗結(jié)果可以做出如下解釋：盡管短寡核苷酸可以借助3′末端連續(xù)的4個堿基牢固地結(jié)合到引物序列的3′末端，但余下的序列太短而無法與引物序列在空間上形成相互作用力而沒有起到橋接促進作用。Brownie等［7］提到的在引物對的5′端增加一段相同的序列后抑制引物二聚體的機制是由于退火溫度下優(yōu)先形成了袢式結(jié)構(gòu)而避免與引物序列的結(jié)合的理論是不全面的，因為100%反向相同的引物對可以形成引物二聚體（Ct值為30．5），但是反向完全相同的引物對形成的引物二聚體中一條鏈在退火溫度下，自身的序列可以在空間中通過反向互補形成環(huán)形結(jié)構(gòu)，這樣可以避免引物序列與之結(jié)合后形成引物二聚體，但是本研究中的實驗結(jié)果是這種推斷所無法解釋的，所以認為文獻中提出的抑制引物二聚體形成的模式不是主要原因［8－9］。本研究提出的機制和實驗方法為進一步研究寡核苷酸序列之間的相互作用提供了切入點。

綜上所述，SYBR GreenⅠReal－time PCR反應(yīng)優(yōu)化的關(guān)鍵在于引物設(shè)計，在采用部分同向相同的引物對的基礎(chǔ)上加用其他的優(yōu)化方法如PCR增效劑可以實現(xiàn)加強效果，普通引物對加用PCR增效劑幾乎沒有優(yōu)化效果（圖4）。針對同一個試劑盒中的質(zhì)粒標準品做標準曲線的結(jié)果說明部分相同的引物對使得檢測低濃度樣本更加精確、可靠（圖5）。在實際應(yīng)用中，布魯桿菌、乙肝病毒、艾滋病病毒、多重腸道病毒的定量檢測都可以應(yīng)用部分相同的引物對來檢測低濃度樣本。SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR技術(shù)準確、線性關(guān)系好、線性范圍寬并且經(jīng)濟高效，但是因為假陽性的問題而無法實現(xiàn)廣泛地應(yīng)用，該研究有效解決了此問題，從而為拓寬其在相關(guān)領(lǐng)域尤其是分子診斷方面的應(yīng)用范圍起到重要的作用。

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