陳佳，梁燕玲，鄭璿，陳智毅，劉宇明，李斯穎

機械振蕩法制備激肽原酶載藥微泡的實驗研究

陳佳a，梁燕玲a，鄭璿a，陳智毅b，劉宇明a，李斯穎a

目的：探討機械振蕩法制備激肽原酶載藥微泡的最佳參數(shù)。方法：機械振蕩法制備激肽原酶載藥微泡，利用不同的振蕩時間，激肽原酶與微泡不同的混合比例，檢測載藥微泡的攜帶率、激肽原酶的效價、載藥微泡的粒徑及粒徑分布、濃度、pH值、包封率。結(jié)果：振蕩時間在45 s，載藥微泡攜帶率最高，為（93.46± 1.7）%。激肽原酶與微泡混合比在4∶1的條件下，激肽原酶效價最高且達到合格標準。載藥微泡的表面電位為（－56.47±8.23）mV，平均粒徑為（13.2±7.3）μm，粒徑范圍為6～20 μm，濃度為（6～7）×108/mL，pH值為（6.20±0.01），包封率為（52.5±0.8）%。結(jié)論：采用機械振蕩法可成功制備激肽原酶載藥微泡，該載藥微泡藥物攜帶率高，穩(wěn)定性較好，且能維持良好的藥物效價。

激肽原酶；微泡；機械振蕩

急性缺血性腦卒中占全部腦卒中的60%～80%[1]。超聲介導微泡造影劑攜帶藥物靶向治療技術(shù)具有高效、靶向性強的優(yōu)點[2]，可降低治療成本和副作用，且不影響藥物的活性。若能把該技術(shù)應(yīng)用于急性腦梗死的治療，應(yīng)該具有廣闊的前景。人尿激肽原酶（urinary kallikrein,UK）可通過建立側(cè)枝循環(huán)、促進神經(jīng)修復的雙重機制來提高急性腦梗死后腦的儲備能力。現(xiàn)有證據(jù)表明，人UK注射能減少急性缺血性腦卒中后神經(jīng)功能缺損，改善長期預(yù)后[3]。本研究探索機械振蕩法制備激肽原酶載藥微泡的最佳參數(shù)，為超聲介導微泡造影劑攜帶藥物靶向治療技術(shù)應(yīng)用于急性腦梗死的臨床治療打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑：注射用六氟化硫（SF6）微泡（聲諾維，購于瑞士Bracco Suisse SA公司）；注射用尤瑞克林（產(chǎn)品批號311112011，購于廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司），主要成分為人 UK；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）標記的UK—FITC-UK（由吉爾生化上海有限公司合成）；底物S-2266 （H-D-Val-Leu-Arg-PNA·2HCl，25 mg，MW579.6，購于意大利Chromogenix公司）。儀器：FACS Calibur流式細胞儀（購于美國BD公司）；ST-B型膠囊式銀汞調(diào)和器（購于北京安泰生物醫(yī)用材料有限公司）；熒光顯微鏡（購于德國Leica Dmirb公司）；UVMINI-1240紫外分光光度儀、LC-20A反向高效液相色譜儀（購于日本島津公司）；激光粒度測量儀（購于荷蘭Ankersmid公司）；表面電位測量儀（購于英國Malvern公司）；細胞計數(shù)儀（購于美國Beckman Coulter公司）；pH計（購于瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 方法

1.2.1 UK載藥微泡的制備 一支注射用SF6微泡用5 mL生理鹽水溶解，用力振搖20 s直至瓶中內(nèi)容物混合均勻，成乳白色混懸液，其濃度為每毫升微泡混懸液含SF68 μL（45 μg）。一支UK（0.15 PNA單位）用20 mL生理鹽水溶解。根據(jù)微泡與UK混合的體積比，分為4組，分別為（2∶1）組、（1∶1）組、（1∶2）組、（1∶4）組，各組分別按比例取適量分裝于西林瓶中避光密封保存?zhèn)溆?。機械振蕩儀系膠囊式調(diào)和器改裝而成，水平往復式振蕩，工作頻率≥4 500次/min，振動幅度為（15±1）mm[4]。把UK和脂質(zhì)微泡混合液置于機械振蕩儀，分別振蕩15、30、45、60、90 s。振蕩完成后，分別取微量混合液滴于載玻片上，抗熒光淬滅劑封片。

1.2.2 吸光度檢測 檢測A405nm值并計算載藥微泡中UK的效價，由廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司質(zhì)量控制部協(xié)助完成。試劑配制：0.2 mol/L三羥甲氨基甲烷緩沖液（pH8.0）（三羥甲基氨基甲烷24.2 g，加純化水800 mL溶解，用6 mol/L鹽酸調(diào)pH至8.0，再加純化水至1 000 mL，混勻即得）；供試品溶液（取本品適量，加0.2 mol/L三羥甲氨基甲烷緩沖液（pH8.0）制成0.03 PNA單位/mL的溶液）；底物溶液（取S-2266一支，加入14.4 mL純化水，制成0.003 mol/L貯存液，－20℃凍存，1年內(nèi)使用。臨用時，用純化水稀釋至0.001 5 mol/L使用）；50%醋酸溶液（量取 50 mL醋酸，加純化水至100 mL，混勻即得）。檢測取3支供試品管，平行操作，步驟如下：空白管和供試品管分別加入0.2 mL供試品溶液和4.0 mL的0.2 mol/L三羥甲氨基甲烷緩沖液（pH8.0），置（37±0.5）℃水浴5 min后，空白管加入50%醋酸溶液0.4 mL，供試品管加入底物溶液0.4 mL，立即混勻，置（37±0.5）℃水浴15 min后空白管加入底物溶液0.4 mL。以空白管調(diào)零，測定樣品A405nm值。計算效價：PNA單位/mL＝173.6×A405nm×T/1000，173.6為反應(yīng)常數(shù)，T為稀釋倍數(shù)，1000為L與mL換算值。PNA單位/mL值在90%～115%之間為合格。

1.2.3 載藥微泡的表征 在普通光鏡下觀察微泡的形態(tài)、大??；熒光顯微鏡下觀察微泡的熒光標記情況；流式細胞儀分析UK的攜帶率及穩(wěn)定性[5]；馬爾文表面電位測量儀檢測微泡的表面電位，激光粒度儀測量微泡粒徑及粒徑分布；細胞計數(shù)儀檢測微泡的濃度；pH計測量微泡的pH值。

1.2.4 反向高效液相色譜法（reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)測量包封率 PAD紫外雙通道檢測器；LC色譜分析軟件；ZORBAX Eclipse XDB-C18；C18色譜柱（4.6 μm×250 mm，300 A，粒徑5 μm）；甲酸、乙腈均為HPLC純。流動相A為（含0.05%甲酸的超純水），流動相B為乙腈；流動相比例為A∶B=75∶25，HPLC參數(shù)設(shè)置：柱溫40℃，檢測波長280 nm，流速1.0 mL/min，藥物5 μL進樣檢測峰面積。采用RP-HPLC和超速離心法測定UK總量和游離UK量，按如下公式計算：包封率（%）=[（投入藥量－游離藥量）/投入藥量]×100%。

1.3 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS19.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以（均值±標準差）表示，檢驗，<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 微泡的肉眼及鏡下觀

UK載藥微泡外觀呈乳白色混懸液。在光學顯微鏡下可見微泡呈圓形，細密，分布均勻，無聚集現(xiàn)象；熒光顯微鏡下可見結(jié)合UK的微泡表面發(fā)出綠色熒光，普通微泡無熒光表現(xiàn)，見圖1。

2.2 載藥微泡的攜帶率

流式細胞儀分析結(jié)果顯示，45 s振蕩時間下UK的攜帶率最高，為（93.46±1.7）%，60和 90 s的攜帶率為（93.28±0.50）%、（92.21±1.7）%，15 s振蕩時間下藥物攜帶率最低，為（58.9±7.83）%，差異有統(tǒng)計學意義（<0.05），見圖2。

圖1 光鏡（A）和熒光顯微鏡（B）觀察稀釋100倍后載FITC-UK微泡（×100）

圖2 不同振蕩時間下載藥微泡攜帶率的比較（n=5）

2.3 UK效價檢驗

（2∶1）組、（1∶1）組、（1∶2）組、（1∶4）組的UK效價分別為（83.3±0.2）%、（84.0± 0.6）%、（89.3±0.2）%、（109.3±0.3）%。（1∶4）組的UK效價最高，達到合格標準。

2.4 微泡粒徑及其分布

激光粒度測量儀檢測可見，空白微泡的粒徑為8.1 μm（8.1 μm，8.1 μm），分布穩(wěn)定；載藥微泡的粒徑為10.54 μm（5.66 μm，25.17 μm），見圖3。

2.5 微泡表面Zeta電位

馬爾文表面電位測量儀檢測空白微泡表面電位為（－28.76±3.15）mV，載藥微泡的表面電位為（－56.47±8.23）mV，其表面電位的絕對值較空白微泡升高，差異有統(tǒng)計學意義（<0.05）。空白微泡、載藥微泡的pH值分別為（5.78±0.02）、（6.20±0.01），差異無統(tǒng)計學意義（>0.05），見圖4。

2.6 RP-HPLC檢測包封率

載藥微泡 UK的包封率為（52.5± 0.8）%，見圖5。

3 討論

近年來各種可攜帶藥物或基因的超聲微泡造影劑不斷研制成功，超聲介導微泡造影劑攜帶藥物和基因靶向治療技術(shù)的應(yīng)用日益廣泛，其機制主要是利用超聲的“空化效應(yīng)”?？栈?yīng)是指液體中存在的微小氣泡（空化核）在超聲作用下產(chǎn)生壓縮和膨脹。超聲微泡造影劑可被視為人造空化核，在低聲壓下，微泡產(chǎn)生對稱性的壓縮和膨脹，氣泡的直徑保持相對恒定而不破裂，稱為穩(wěn)態(tài)空化。在高聲壓下，微泡產(chǎn)生不對稱的壓縮和膨脹，最終發(fā)生內(nèi)爆破裂，這種現(xiàn)象稱為瞬態(tài)空化。在微泡造影劑發(fā)生瞬態(tài)空化的同時可伴隨產(chǎn)生沖擊波和微射流，使周圍組織細胞膜發(fā)生可逆或不可逆的穿孔，增加細胞膜和微血管壁的通透性；與此同時，在沖擊波和微射流的推動作用下，從破裂的微泡中釋放出來的藥物或基因更易進入組織細胞或靶器官。在超聲作用下，微泡造影劑增強細胞的吞噬作用，從而使細胞對藥物或基因的攝入能力顯著增強。有研究把抑制沉默基因的質(zhì)粒與微泡造影劑混合后注入小鼠體內(nèi)，然后使用超聲輻照已移植入小鼠體內(nèi)的人宮頸癌細胞腫瘤，大大增加腫瘤細胞的凋亡，從而靶向治療腫瘤組織[7]。因此，超聲介導超聲微泡造影劑攜帶藥物和基因靶向治療技術(shù)具有高效和靶向性強的優(yōu)點。另外，微泡造影劑在血中的溶解度和彌散度差、穩(wěn)定性好，使用微泡造影劑攜帶藥物，可避免藥物在血液循環(huán)中被迅速降解，從而減少藥物用量，減少藥物的副作用、降低治療費用。部分臨床試驗證實，同時應(yīng)用微泡造影劑可降低超聲治療的強度，從而提高超聲助溶的效率和降低出血等副作用，而且體內(nèi)使用微泡造影劑是安全的[8,9]。若把該技術(shù)應(yīng)用于急性腦梗死的治療，應(yīng)該具有廣闊的前景。

圖3 空白微泡（A）及載藥微泡（B）粒徑分布圖

圖4 載藥微泡的表面Zeta電位圖

圖5 進樣5 μL的峰面積

人UK是近年研制成功的國家Ⅰ類新藥，可提高急性腦梗死后腦的儲備能力，改善預(yù)后，且時間窗寬廣、無繼發(fā)出血的副作用，目前已被最新版的《中國急性缺血性腦卒中診治指南2010》列為急性腦梗死的治療藥物之一。因此，UK可作為發(fā)揮超聲介導微泡造影劑攜帶藥物靶向治療技術(shù)優(yōu)勢的理想藥物。

本實驗采用的微泡是注射用SF6，本品組成為白色凍干粉末，上充SF6氣體；凍干粉末輔料組成：聚乙二醇4000、二硬脂磷酯酰膽堿、二棕櫚磷酯酰甘油、棕櫚酸。SF6是一種惰性無毒氣體，在水溶液中溶解度極低，注射后2 min內(nèi)，80%的SF6氣體排出；注射15 min后，幾乎所有的SF6氣體都已排出，因此安全性高，無細胞毒作用。制備UK載藥微泡是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前國內(nèi)外常用的載藥微泡的制備方法有機械振蕩法、冷凍干燥法、中和法、吸附法、聲空化法和薄膜水化法等。多數(shù)文獻認為機械振蕩法穩(wěn)定、制備工藝簡單、控制性好，可獲得較高的轉(zhuǎn)染率[10]。因此，本研究采用機械振蕩法制備UK載藥微泡，且采用不同的振蕩時間及不同的藥物/微泡混合比，試圖探索一種能使載藥微泡攜帶率最高且藥物活性最高的條件。本研究結(jié)果表明，機械振蕩30 s以上，可將UK成功地連接在微泡上，熒光顯微鏡下可見載藥微泡發(fā)出綠色熒光，普通微泡則無熒光表現(xiàn)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示載藥微泡有較高的藥物攜帶率。但是，本研究尚不能確定藥物是黏附在微泡表面還是包裹進入微泡脂質(zhì)膜內(nèi)。Zeta電位測量結(jié)果顯示，載藥微泡的表面Zeta電位明顯下降，所以筆者初步推測，帶負電的UK有相當一部分是黏附在微泡表面。Zeta電位的重要意義在于它的數(shù)值與膠態(tài)分散的穩(wěn)定性相關(guān)，分子或分散粒子越小，Zeta電位（正或負）越高，體系越穩(wěn)定。一般認為，當Zeta電位的絕對值達30 mV，體系穩(wěn)定[11]。空白微泡粒徑平均值為8.1 μm，標準差為0，大小分布穩(wěn)定，而載藥微泡與空白微泡相比，粒徑有所增加，且粒徑分布較空白微泡廣泛，這也從另一個角度解釋了UK的攜帶部位可能位于微泡表面。

UK被微泡造影劑成功攜帶是制備載藥微泡技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而保持UK的活性更是核心所在。本實驗嘗試了4種不同的UK與微泡的混合比，通過吸光度檢測法檢測A405nm值并計算出載藥微泡中UK的效價，實驗結(jié)果表明，在混合比為4∶1的情況下，UK效價達到藥物合格標準。

綜上所述，本實驗基本成功制備UK載藥微泡，其形態(tài)規(guī)則，分散情況良好，性質(zhì)較穩(wěn)定，為進一步應(yīng)用超聲介導微泡攜帶UK靶向治療急性腦梗死提供技術(shù)平臺。

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Preparation of Kallidinogenase-loaded Microbubbles using Mechanical Shaking Method

Objective:To investigate the optimal parameters for preparing Kallidinogenase-loaded microbubbles (KLMs)by mechanical shaking method.Methods:Kallidinogenase-loaded microbubbles were prepared using mechanical shaking method.Different shaking time and mixing ratio were used.The carrying rate and stability of Kallidinogenase were analyzed.The A405nmvalue of the Kininogenase was tested and calculated for the assay of the Kallidinogenase.The characterization and properties(appearance,surface potential,size,distribution,concentration,and pH value)of the microbubbles were observed.The enclosed efficiency of Kininogenase was detected. Results:The best shaking time was 45 s with carrying rate of(93.46±1.7)%.Kininogenase assay was up to standard when the Kininogenase and microbubbles mixture ratio was 4∶1.The mean surface potential was(－56.47± 8.23)mV,the mean diameter was(13.2±7.3)μm，ranged from 6～20 μm.The concentration was(6～7)×108/mL, pH value was(6.20±0.01),the drug enclosed efficiency was（52.5±0.8）%.Conclusion:The Kallidinogenase-loaded microbubbles,with ideal characters of safety and efficacy,could be successfully prepared via mechanical shaking method.

Kallidinogenase;microbubbles;mechanical shaking

R741;R741.05

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.02.003

廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院a.神經(jīng)內(nèi)科b.超聲醫(yī)學科廣州 510150

廣東省自然科學基金面上項目（No.S201101000329 5）

2013-11-04

梁燕玲elaine.liang@163.com