陳忠云，李珊珊，李婧，徐志偉，楊旭

阿司匹林廣泛應(yīng)用于卒中的一、二級(jí)預(yù)防。研究表明，高危險(xiǎn)因素的腦血管病患者，服用阿司匹林可降低25%的非致死性卒中[1]。然而，部分長(zhǎng)期服用阿司匹林的患者，心腦血管事件的發(fā)生率并未降低，可能在一定程度上存在阿司匹林抵抗（aspirin resistance，AR）現(xiàn)象[2,3]。研究表明，遺傳因素在抗血小板藥物實(shí)驗(yàn)室反應(yīng)中起重要作用[4]。環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX）為阿司匹林的主要作用靶點(diǎn)，近年有關(guān)COX-2基因多態(tài)性與AR的相關(guān)報(bào)道較多，但大多研究基于-765G>C位點(diǎn)[5]，關(guān)于-1195G>A位點(diǎn)的研究較少。基于此，本研究探討COX-2基因-1195G>A多態(tài)性與缺血性腦卒中（ischem ic stroke，IS）患者AR的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2011年12月至2013年6月我科收治的IS患者210例，均符合2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)發(fā)布的急性IS診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，并經(jīng)頭顱CT和/或MRI證實(shí)，均為中國(guó)北方漢族，男123例，女性87例；平均年齡（64.96±12.57）歲；排除感染及血液系統(tǒng)性疾病，近1周未使用其他抗血小板藥物，如氯吡咯雷、華法林等。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

參考Gum等[7]提出的實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)，以 10μmoL/L二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）誘導(dǎo)的血小板聚集率≥70%；以0.5mg/m L花生四烯酸（arachidonic acid，AA）誘導(dǎo)的血小板聚集率≥20%。2項(xiàng)都符合，為AR（n=17）；符合其中1項(xiàng)，為阿司匹林半抵抗（aspirin sem i-resistance，ASR）（n=46）；2項(xiàng)都不符合，為阿司匹林敏感（aspirin sensitive，AS）（AS組，n=147）。因AR患者較少，故與ASR患者合并為非AS組。全部患者住院次日清晨空腹抽取肘靜脈血，用全自動(dòng)分析儀測(cè)定甘油三酯（triglyceride，TG）、膽固醇（Cholesterol，Cho）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）等指標(biāo)。受試者清晨另空腹采肘靜脈血2m L，枸櫞酸鈉-K2抗凝，按照DNA提取試劑盒（購(gòu)于北京天根公司）操作，提取全血標(biāo)本DNA，－80℃保存?zhèn)溆谩２捎肨aqExpress軟件（購(gòu)于美國(guó)ABI公司）設(shè)計(jì)引物和探針，由北京賽百盛生物技術(shù)公司合成。測(cè)定的基因型均通過(guò)測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證。-1195 G>A點(diǎn)突變擴(kuò)增片段長(zhǎng)度119 bp，引物3′端-2位引入錯(cuò)配堿基“T”（正配堿基應(yīng)為“A”）。運(yùn)用擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（Ampli cation refractorymutation system，ARMS）結(jié)合TaqMan熒光探針的方法（ARMS-Taq-Man）檢測(cè)基因型，其中，野生引物為5′AAC AAA AGC AAA GAT GAA ATT CCTA 3′，突變引物為 5′ACA AAA GCA AAG ATG AAA TTC CTG 3′（序列中下劃線堿基是引入的錯(cuò)配堿基，用以增加引物特異性），TaqMan序列為 5′HEL-TCT CCC TTC CAT CTA ATT AAT TCC TCA T-3′-BHQ。ARMS-TaqMan法的反應(yīng)體系及測(cè)定條件：反應(yīng)體系為20μL，反應(yīng)液8μL，上、下游引物各1μL，增強(qiáng)液1μL，模板 2 μL，探針 1μL，H2O 6μL，使用 7 500熒光定量PCR測(cè)定儀（美國(guó)ABI公司）檢測(cè)探針羧基熒光素的熒光信號(hào)。-1195G>A點(diǎn)突變反應(yīng)條件為 94℃ 5m in，94℃ 25 s，60℃35 s40個(gè)循環(huán)，以2~9個(gè)循環(huán)為基線，閾值為0.02確定循環(huán)閾值（Ct值）。ARMS-Taq-Man方法檢測(cè)不同基因型判定標(biāo)準(zhǔn)的建立：利用引物3′端與模板正配與錯(cuò)配擴(kuò)增效率不同，以已知濃度梯度不同基因型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，按上述反應(yīng)條件，通過(guò)熒光信號(hào)檢測(cè)確定PCR反應(yīng)有無(wú)指數(shù)擴(kuò)增期和Ct值，確定可區(qū)分點(diǎn)突變檢測(cè)的濃度范圍。在可區(qū)分點(diǎn)突變檢測(cè)的濃度范圍內(nèi)，以不同拷貝數(shù)的野生引物Ct值（Wct）和突變引物Ct值（Mct）差值Δct（Δct=Wct-Mct），根據(jù)總體均數(shù)計(jì)算 Δct的 99%可信區(qū)間（Δct±2.58 s）及PCR擴(kuò)增時(shí)有無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期，建立各種等位基因型的判定標(biāo)準(zhǔn)。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，組間比較用x2檢驗(yàn)；定量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，采用t檢驗(yàn)或W ilcoxon秩和檢驗(yàn)。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，2組SNPs的基因型和等位基因的頻率差異采用x2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。多因素分析采用多元Logistic回歸分析。所有資料采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基線資料比較

①AS組 147例，男 90例（61.2%）；年齡（64.39±12.45）歲；吸煙史 50例（34.0%），飲酒史36例（24.5%）；原發(fā)性高血壓91例（61.9%），糖尿病 53例（36.1%），冠心病 71例 （48.3%）；TG （1.46±0.71）mmol/L，Cho（4.49±1.17）mmol/L，HDL （1.13±0.29）mmol/L，LDL（2.83±0.84）mmol/L；②非AS組63例，男33例（52.4%）；年齡（66.29±12.83）歲；吸煙史 24例（38.1%），飲酒史17例（27.0%）；原發(fā)性高血壓40例（63.5%），糖尿病 17例（27.0%），冠心病 28例 （44.4%）；TG （1.31±0.59）mmol/L，Cho（4.51±1.11）mmol/L，HDL （1.11±0.28）mmol/L，LDL（2.76±0.71）mmol/L。各項(xiàng)指標(biāo)組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 COX-2基因-1195G>A基因型和等位基因頻率分布

COX-2基因-1195G>A基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），具有群體代表性。應(yīng)用x2檢驗(yàn)比較-1195G>A位點(diǎn)基因型、顯性模型在2組間的分布頻率差異，結(jié)果提示差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。非 AS組中 -1195G>A位點(diǎn)（GA+AA）基因型頻率及A等位基因頻率高于AS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=4.96，P=0.03；x2=5.50，P=0.02），見表 1。

2.3 多因素Logistic回歸分析

進(jìn)一步采用多元Logistic回歸模型校正年齡、性別、吸煙史、飲酒史、原發(fā)性高血壓、糖尿病、冠心病、TG、TC、LDL及HDL后，結(jié)果顯示，與GG基因型相比，COX-2的-1195G>A位點(diǎn)（GA+AA）基因型發(fā)生AR可能性更大 （OR=2.41，95%CI為1.09~5.37，P=0.03）。

3 討論

根據(jù)檢測(cè)手段及研究人群的不同，AR發(fā)生率在國(guó)內(nèi)外研究中差異很大，為5%~40%[7-9]。本研究中AR及ASR的發(fā)生率分別為8.1%和21.9%，與既往報(bào)道一致[10]。

COX-2位于1號(hào)染色體q25.2-q25.3，長(zhǎng)約8.3 kb，由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子組成。COX-2為誘導(dǎo)型酶，在正常情況下，COX-2低表達(dá)或不表達(dá)，但在炎性介質(zhì)、生長(zhǎng)因子等體內(nèi)外因素誘導(dǎo)下表達(dá)，可將AA轉(zhuǎn)化為前列腺素H2，前列腺素H2可增加血栓素A2的生成，從而誘導(dǎo)血小板聚集、粘附和血管收縮。本研究結(jié)果表明，與GG基因型及G等位基因相比，COX-2基因-1195G>A位點(diǎn)（GA+AA）基因型及攜帶等位基因A的IS患者發(fā)生AR的可能性更大。校正相關(guān)危險(xiǎn)因素后，（GA+AA）基因型仍與AR的發(fā)生呈顯著相關(guān)（P=0.03），提示其可能是AR發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這與國(guó)內(nèi)徐旭等[11]的研究相一致。然而，國(guó)內(nèi)亦有相反結(jié)論的報(bào)道，王毅盟等[12]研究發(fā)現(xiàn)-1195G>A位點(diǎn)基因型分布頻率在AS組及非AS組中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.02），但多因素分析提示-1195G>A位點(diǎn)與AR的發(fā)生無(wú)關(guān)。這些矛盾的結(jié)果可能與納入研究對(duì)象不同有關(guān)，既往研究對(duì)象包括冠心病、IS、肺梗死等患者，而本研究對(duì)象僅為IS患者，避免了病因不同所引起的偏移。此外，Chen等[13]研究提示，-1195G>A位點(diǎn)（GA+AA）基因型與IS密切相關(guān)，那么，-1195G>A位點(diǎn)突變的IS患者是否更易發(fā)生AR呢，仍需進(jìn)一步研究。

-1195G>A位于啟動(dòng)子區(qū)，啟動(dòng)子區(qū)含多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，因此，其基因多態(tài)性可能改變基因的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而影響COX-2的表達(dá)。Zhang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，-1195G>A多態(tài)性改變可產(chǎn)生一個(gè)新的c-MYB的轉(zhuǎn)錄因子，從而增強(qiáng)COX-2基因的轉(zhuǎn)錄活性。既往研究提示，COX-2在動(dòng)脈粥樣硬化的形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并與粥樣斑塊的穩(wěn)定性有關(guān)[15]。COX-2的表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶對(duì)血管膠原的分解作用，從而使粥樣斑塊的穩(wěn)定性降低，進(jìn)而導(dǎo)致患者對(duì)阿司匹林不敏感，從而產(chǎn)生AR。

綜上，本研究顯示，COX-2基因-1195G>A位點(diǎn)多態(tài)性可能是造成AR及ASR原因之一。因此，檢測(cè)COX-2基因-1195G>A位點(diǎn)多態(tài)性，對(duì)臨床實(shí)施個(gè)體化藥物治療，預(yù)防心腦血管病的發(fā)生具有重要意義。但仍需進(jìn)行大樣本的前瞻性研究，進(jìn)一步明確-1195G>A位點(diǎn)基因多態(tài)性與IS患者發(fā)生AR的相關(guān)性。

表1 COX-2基因-1195G>A基因型、顯隱性模型及等位基因分布頻率（n，%）

[1]Antithrombotic Trialists'Collaboration.Collaborative meta-analysis of random ised trials of antiplatelet therapy for prevention of death,myocardial infarction,and stroke in high risk patients[J].BMJ,2002,324:71-86.

[2]McKee SA,Sane DC,Deliargyris EN.Aspirin resistance in cardiovascular disease:a review of prevalence,mechanisms,and clinical significance[J].Thromb Haemost,2002,88:711-715.

[3]Zheng AS,Churilov L,Colley RE,etal.Association ofaspirin resistancew ith increased stroke severity and infarctsize[J].JAMA Neurol,2013,70:208-213.[4]O'Donnell CJ,Larson MG,Feng D,etal.Genetic and environmental contributions to platelet aggregation:the Framingham heart study[J].Circulation,2001,103:3051-3056.

[5]Sharma V,Kaul S,A l-Hazzani A,etal.Association of COX-2 rs20417 w ith aspirin resistance[J].J Thromb Thrombolysis,2013,35:95-99.

[6]中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)腦血管病學(xué)組急性缺血性腦卒中診治指南撰寫組.中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2010[J].中華神經(jīng)科雜志,2010,43:146-153.

[7]Gum PA,Kottke-Marchant K,Poggio ED,et al.Profile and prevalence of aspirin resistance in patients

w ith cardiovascular disease[J].Am JCardiol,2001,88:230-235.

[8]Patrono C.Aspirin resistance:definition,mechanisms and clinical read-outs[J].JThromb Haemost,2003,1:1710-1713.

[9]Narvaez I,Sagastagoitia JD,Vacas M,et al.Prevalence and biologic profile of aspirin resistance in patientsw ith angiographically proven coronary artery disease[J].Thromb Res,2007,120:671-677.

[10]Canivano Petrenas L,Garcia Yubero C.Resistance to aspirin:prevalence,mechanismsof action and association w ith thromboembolic events.A narrative review[J].Farm Hosp,2010,34:32-43.

[11]徐旭,陳忠云,李婧,等.335例心腦血管病患者阿司匹林抵抗與環(huán)氧化酶2基因多態(tài)性位點(diǎn)的相關(guān)性 [J].中華老年心腦血管病雜志,2013,15:602-606.

[12]王毅盟,倪培華,楊蓉,等.環(huán)氧化酶-2啟動(dòng)子區(qū)基因單核苷酸多態(tài)性與老年人阿司匹林抵抗的關(guān)系 [J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）,2012,32:301-306.

[13]Chen GZ,Shan XY,Cheng GP,etal.Cyclooxygenase-2 genetic polymorphism and stroke subtypes in Chinese[J].JMolNeurosci,2013,51:467-473.

[14]Zhang X,Miao X,Tan W,etal.Identification of functional genetic variants in cyclooxygenase-2 and their association w ith risk of esophageal cancer[J].Gastroenterology,2005,129:565-576.

[15]Cuccurullo C,Fazia ML,Mezzetti A,et al.COX-2 expression in atherosclerosis:the good,the bad or the ugly?[J].Curr Med Chem,2007,14:1595-1605.