張穎,孟冬芳,王志剛,郭火生,王洋
(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,哈爾濱 150030)
Acinetobacter lwoffii DNS32對阿特拉津污染的氧化應(yīng)激響應(yīng)
張穎,孟冬芳,王志剛,郭火生,王洋
(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,哈爾濱 150030)
文章探討以A.lwoffiiDNS32為試驗(yàn)菌株革蘭氏陽性菌S.aureusR2經(jīng)阿特拉津處理后,于0、6、12和24 h取樣測定SOD、CAT、GST活性和T-AOC。結(jié)果表明,暴露6 h,兩菌株T-AOC受到誘導(dǎo),SOD、CAT和GST活性最大誘導(dǎo)率分別為111.26%和55.47%,72.79%和61.61%,33.35%和52.76%。暴露24 h,A.lwoffiiDNS32 SOD和CAT受到誘導(dǎo),GST和T-AOC受到抑制,而S.aureusR2 SOD、CAT、GST活性和T-AOC都受到抑制。與S.aureusR2相比,A.lwoffiiDNS32對阿特拉津氧化脅迫的耐受性相對較高。
阿特拉津;阿特拉津降解菌;抗氧化酶;活性氧自由基(ROS)
活性氧自由基(ROS)是細(xì)胞有氧呼吸代謝過程中的副產(chǎn)物,氧化應(yīng)激特征是生成ROS。多數(shù)污染物具有氧化還原活性,可參與生物體內(nèi)氧化還原循環(huán),產(chǎn)生大量ROS等有害物質(zhì),若ROS產(chǎn)生速度超出抗氧化防御系統(tǒng)清除能力,對機(jī)體造成氧化脅迫,引起脂質(zhì)過氧化、DNA鏈斷裂、堿基核糖基氧化、酶蛋白膠聯(lián)以致細(xì)胞死亡或癌變[1]??寡趸腹δ苁乔宄齊OS保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受氧自由基損傷,其活性能間接反映機(jī)體細(xì)胞中ROS濃度變化。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)3種主要抗氧化防御酶是誘導(dǎo)酶,通過代償機(jī)制能被輕微氧化應(yīng)激誘導(dǎo),嚴(yán)重氧化應(yīng)激會導(dǎo)致代償機(jī)制的缺失和細(xì)胞氧化損傷而抑制酶活性[2]??寡趸烙赶抵匾卣魇瞧浠钚曰蚝坑捎谖廴久{迫而發(fā)生改變,能間接反映環(huán)境中氧化作用存在,可作為環(huán)境污染脅迫程度指標(biāo)。目前,細(xì)菌對某些污染物氧化脅迫響應(yīng)已得到廣泛研究[3-5],但針對阿特拉津?qū)?xì)菌污染脅迫研究甚少。阿特拉津可通過產(chǎn)生ROS造成DNA鏈斷裂對生物機(jī)體存在基因毒性[6]。關(guān)于阿特拉津通過增加ROS濃度誘導(dǎo)生物體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),通過影響抗氧化酶活性使生物體產(chǎn)生氧化損傷[7]研究較少,而且集中在動物和植物方面,阿特拉津?qū)?xì)菌等微生物氧化脅迫方面研究尤為少見。A.lwoffiiDNS32是以阿特拉津?yàn)槲ㄒ坏吹母锾m氏陽性高效阿特拉津降解菌株,因此,本文以A.lwoffiiDNS32為試驗(yàn)材料,革蘭氏陽性菌S.aureusR2為對照菌株,通過將其暴露到不同濃度阿特拉津中,探討菌中SOD、CAT、GST活性和總抗氧化能力(T-AOC)對阿特拉津污染氧化應(yīng)激響應(yīng),為阿特拉津?qū)Νh(huán)境微生物抗氧化酶系的生態(tài)毒理學(xué)研究提供理論依據(jù),為篩選出對阿特拉津污染脅迫耐受性強(qiáng)的高效降解菌提供技術(shù)支撐。
1.1 菌株及生長條件
阿特拉津純度≥97%,其余試劑為分析純或超級純。T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。AcinetobacterlwoffiiDNS32(A.lwoffiiDNS32)是從黑龍江省長期施用阿特拉津的黑土耕層中篩選得到的高效阿特拉津降解菌,對阿特拉津72 h的降解率達(dá)到98.91%。StaphylococcusaureusR2(S.aureusR2)由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。菌株接種到液體LB培養(yǎng)基(pH 7.0)中,30℃,150 r·min-1培養(yǎng)。
1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
菌株接種在液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12~18 h,按2%接種量接種到1個(gè)新的液體LB培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,加入適量的阿特拉津,使其在培養(yǎng)液中的終濃度為0、2、5、10、15和20 mg·L-1,繼續(xù)培養(yǎng),分別在阿特拉津加入后0、6、12和24 h取樣用于粗酶制備。每個(gè)處理設(shè)3組平行。
1.3 粗酶制備
細(xì)菌培養(yǎng)液經(jīng)6 000 r·min-1離心15 min收集菌體后,用預(yù)冷的0.9%生理鹽水洗滌2次,重懸于3 mL預(yù)冷0.9%生理鹽水中,冰浴超聲破碎,工作時(shí)間3 s,間歇3 s,重復(fù)99次。破碎后的細(xì)胞10 000 r·min-1,4℃離心10 min后將上清轉(zhuǎn)入新的無菌離心管中-20℃儲存用于酶活的測定。
1.4 酶活測定
采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測定抗氧化酶活性。
SOD活性單位定義:每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位(U)(U·mg-1·protein)。
CAT活性單位定義:每毫克組織蛋白中過氧化氫酶每秒分解吸光度為0.50~0.55的底物中的過氧化氫相對量為一個(gè)過氧化氫酶的活力單位(U·mg-1· protein)。
GST活性單位定義:每毫克組織蛋白,在37℃反應(yīng)l min扣除非酶促反應(yīng),使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol·L-1為一個(gè)酶活力單位(U)(U·mg-1·protein)。
T-AOC單位定義:在37℃時(shí),每分鐘每毫克組織蛋白,使反應(yīng)體系的吸光度值每增加0.01時(shí),為一個(gè)總抗氧化能力單位(U·mg-1·protein)。
蛋白含量定義:每升上清液中蛋白克數(shù)(g·L-1)。
2.1 菌體中SOD活性變化
如圖1所示,阿特拉津暴露6 h時(shí),兩菌株的SOD活性最大誘導(dǎo)率分別出現(xiàn)在阿特拉津15和10 mg·L-1處,為111.26%和55.47%。A.lwoffiiDNS32受阿特拉津暴露的6、12和24 h,SOD活性隨著阿特拉津濃度的增加都先增后降,各時(shí)間點(diǎn)活性最大值達(dá)到0 h的1.5倍以上,分別出現(xiàn)在阿特拉津15、10和15 mg·L-1處。S.aureusR2的SOD活性從12 h開始下降,24h時(shí)最大抑制率達(dá)44.27%。
SOD能將O2-分解為H2O2和O2[8]。通常認(rèn)為SOD活性的增加與暴露于污染物中的機(jī)體消除氧化應(yīng)激有關(guān)[9],當(dāng)外來脅迫導(dǎo)致大量活性氧產(chǎn)生時(shí),SOD能及時(shí)有效清除自由基,保護(hù)細(xì)胞免受氧化脅迫的傷害。但SOD的過度表達(dá)可能會引發(fā)H2O2這一代謝物的過量積累,致使細(xì)胞中毒[10],細(xì)胞內(nèi)多種功能受到破壞,生理代謝紊亂,SOD活性受到抑制下降,從而導(dǎo)致抗氧化水平的下降。Song等報(bào)道,Vicia faba SOD活性在阿特拉津2.5 mg·L-1時(shí)受到誘導(dǎo),5和10 mg·L-1時(shí)受到抑制,證明阿特拉津誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生[11]。本試驗(yàn)中,A.lwoffiiDNS32 SOD活性整個(gè)暴露時(shí)期均受到誘導(dǎo),說明SOD一直發(fā)揮清除ROS作用,與在仙姑彈琴蛙蝌蚪肌肉組織中研究結(jié)果相反[12]。隨著作用時(shí)間延續(xù),菌體內(nèi)同時(shí)存在兩種反應(yīng),即自由基誘導(dǎo)的抗氧化酶活性增強(qiáng)及自由基對細(xì)胞和抗氧化酶直接損傷而引起抗氧化酶活性下降。在長期作用下,前者表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用,后者表現(xiàn)為抑制作用。在高濃度暴露下,同一時(shí)間點(diǎn)上,A.lwoffiiDNS32 SOD活性均要高于S.aureusR2。而且阿特拉津暴露12 h,S.aureusR2 SOD活性便開始降低,說明A.lwoffiiDNS32對阿特拉津誘導(dǎo)產(chǎn)生的O2-耐受性要高于非阿特拉津降解菌S.aureusR2。
2.2 菌體中CAT活性變化
如圖2所示,阿特拉津暴露6 h時(shí),A.lwoffiiDNS32和S.aureusR2 CAT活性最大誘導(dǎo)率都出現(xiàn)在阿特拉津10 mg·L-1處,分別達(dá)到72.79%和61.61%。A.lwoffiiDNS32阿特拉津暴露各濃度組CAT活性隨著暴露時(shí)間的延長呈現(xiàn)逐漸上升趨勢。與暴露6 h比,菌株S.aureusR2暴露12 h低濃度組CAT活性明顯增加,高濃度組則明顯下降,暴露24 h時(shí),各濃度組CAT活性都低于12 h,在阿特拉津15和20 mg·L-1時(shí)甚至低于0 h,抑制率分別為35.40%和55.75%。
圖1 A.lwoffiiDNS32(A)和S.aureusR2(B)SOD活性變化Fig.1 Variation of SOD activities in A.lwoffiiDNS32(A)and S.aureusR2(B)
圖2 A.lwoffiiDNS32(A)和S.aureu R2(B)CAT活性變化Fig.2 Variation of CAT activities in A.lwoffiiDNS32(A)and S.aureusR2(B)
動植物和微生物細(xì)胞內(nèi)的CAT可催化H2O2分解為H2O和O2,減少過氧化物酶中長鏈脂肪酸代謝物H2O2的積累[13],與生物代謝強(qiáng)度及抗逆境能力密切相關(guān)。Alla等研究表明,經(jīng)阿特拉津處理的玉米CAT活性受到誘導(dǎo),提高玉米抗氧化性[14]。本試驗(yàn)中,A.lwoffiiDNS32 CAT活性整個(gè)暴露時(shí)期均受到誘導(dǎo),與在仙姑彈琴蛙蝌蚪肌肉組織中研究結(jié)果不同[12]。同一時(shí)間點(diǎn)上,A.lwoffiiDNS32 CAT活性高于S.aureusR2,出現(xiàn)該結(jié)果的原因是,A.lwoffiiDNS32菌體內(nèi)阿特拉津污染脅迫產(chǎn)生較多的H2O2,CAT發(fā)揮較高的清除作用。逆境條件下,CAT活性的下降可導(dǎo)致H2O2的累積,過量積累甚至使生物膜結(jié)構(gòu)受到損傷,而CAT活性的提高能更有效清除H2O2。從酶活性的變化趨勢來看,A.lwoffiiDNS32對阿特拉津污染脅迫產(chǎn)生的H2O2耐受性要強(qiáng)于非阿特拉津降解菌S.aureusR2。
2.3 菌體中GST活性變化
如圖3所示,阿特拉津暴露6 h時(shí),兩菌株GST活性都高于0 h最初水平,最大誘導(dǎo)率都出現(xiàn)在阿特拉津15 mg·L-1處,分別為33.35%和52.76%。暴露12 h時(shí)兩菌株的GST活性在阿特拉津5 mg·L-1處達(dá)到最大值,誘導(dǎo)率分別為26.83%和65.70%。24 h時(shí),兩菌株GST活性低于0 h,最大抑制率分別為8.32%和16.60%。
GST是解毒系統(tǒng)第二階段的解毒酶,可催化谷胱甘肽(GSH)與親電中間代謝物的結(jié)合,減少化合物與細(xì)胞內(nèi)生物大分子如DNA等結(jié)合的可能性,還可清除脂類過氧化物,從而去除內(nèi)源性或外源性毒物的毒性,在解毒系統(tǒng)中起重要作用[15]。正是由于GST在生物轉(zhuǎn)化過程中的獨(dú)特功效,菌體中GST活性增加表示菌體內(nèi)相應(yīng)的防御外源性物質(zhì)機(jī)制的建立。隨著阿特拉津污染脅迫的加重,菌體GST活性受到激活,以消除更多的氧化產(chǎn)物;隨著污染脅迫的進(jìn)一步加重,GST活性重新下降至原來水平,甚至受到抑制。
本試驗(yàn)中,兩菌株GST活性在試驗(yàn)短期被誘導(dǎo),長期暴露則受到抑制,這與阿特拉津在鯽魚肝臟[16]中的研究結(jié)果一致,與在中華絨鰲蟹中的研究結(jié)果不同[17]。GST活性下降的原因是作為底物的GSH被大量消耗,同時(shí)解毒過程中產(chǎn)生的大量中間代謝物改變GST亞基的組成降低GST活性或者在體外測定時(shí)與GST底物(如cDNB)發(fā)生競爭性抑制[18]。本試驗(yàn)同一時(shí)間點(diǎn)上,A.lwoffiiDNS32 GST活性高于S.aureusR2,表現(xiàn)出較高敏感性和誘導(dǎo)性,說明A.lwoffiiDNS32 GST在抵抗阿特拉津誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激過程中起重要的解毒作用。
圖3 A.lwoffiiDNS32(A)和S.aureusR2(B)GST活性變化Fig.3 Variation of GST activities in A.lwoffiiDNS32(A)and S.aureusR2(B)
2.4 菌體中T-AOC變化
如圖4所示,6 h時(shí)兩菌株T-AOC隨著阿特拉津濃度增加而增加,最大值分別為20.87和17.74 U·mg-1protein。12 h時(shí)T-AOC呈倒“U”型變化,最大值都出現(xiàn)在阿特拉津10 mg·L-1處。24 h時(shí),低濃度組T-AOC被誘導(dǎo),高濃度組受到抑制,總體上呈現(xiàn)低促高抑現(xiàn)象。
T-AOC是用于衡量機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標(biāo),它的大小代表機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)性能的狀態(tài),從總體上反映機(jī)體防御體系抗氧化能力的高低[19]。細(xì)菌具備抗氧化系統(tǒng)[20],包括一些抗氧化酶及DNA修復(fù)系統(tǒng)等??寡趸赣糜诘钟煌腞OS,因而不同的活性氧類會產(chǎn)生不同的反應(yīng)。本試驗(yàn)經(jīng)阿特拉津暴露后,細(xì)菌相應(yīng)的抗氧化酶活性和總抗氧化能力升高,因?yàn)榘⑻乩蚰軌蛘T導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生ROS,從而對細(xì)菌產(chǎn)生氧化脅迫,作為一種應(yīng)急機(jī)制,菌體產(chǎn)生大量的抗氧化酶抵御氧化脅迫[21]。有研究表明,氯乙酰苯胺類除草劑在前期的脫氯降解中可產(chǎn)生ROS[22-23],其他如聯(lián)吡啶類和合成激素類除草劑,通過電子傳遞鏈的電子流的封鎖誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生,并直接或間接影響膜結(jié)構(gòu)和功能[24-25]。由此推斷,阿特拉津誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)是由于菌體細(xì)胞氧化還原電位失衡引起的,進(jìn)而導(dǎo)致菌體代謝失衡。關(guān)于阿特拉津降解菌抗氧化酶活性的動態(tài)變化及抗氧化機(jī)制,尚待深入研究。
圖4 A.lwoffiiDNS32(A)和S.aureusR2(B)T-AOC變化Fig.4 Variation of T-AOC in A.lwoffiiDNS32(A)and S.aureusR2(B)
經(jīng)阿特拉津暴露,菌體的抗氧化酶活性升高,說明阿特拉津誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),這是由于菌體細(xì)胞氧化還原電位失衡引起,導(dǎo)致菌體代謝失衡。與非阿特拉津降解菌S.aureusR2相比,A.lwoffiiDNS32對阿特拉津氧化脅迫的耐受性相對較高。兩菌株中三種抗氧化酶都參與抗氧化反應(yīng),A.lwoffiiDNS32在抵抗阿特拉津?qū)w產(chǎn)生氧化應(yīng)激作用方面具有優(yōu)勢。
本研究所用高效阿特拉津降解菌是從黑龍江省寒地黑土耕層中篩選得到,由試驗(yàn)結(jié)果可知其對阿特拉津污染脅迫具有較強(qiáng)的抗氧化能力。因此,A.lwoffiiDNS32針對黑龍江省寒地黑土阿特拉津污染治理生物修復(fù)工程,具有很好的應(yīng)用前景。
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Oxidative stress response ofAcinetobacter lwoffii DNS32 exposed to atrazine-contaminated
ZHANG Ying,MENG Dongfang,WANG Zhigang,GUO Huosheng, WANG Yang
(School of Resources and Environmental Science,Northeast Agricultural University, Harbin 150030,China)
To investigate the oxidative stress response of antioxidant enzymes in atrazinedegrading bacterium exposed to atrazine played a significant role in the application of bacterium.A.lwoffiiDNS32 andS.aureusR2 cultures were treated with different concentrations of atrazine.After exposure to atrazine for 0,6,12 and 24 h,bacterial cells were harvested in order to assay SOD,CAT,GST activities and T-AOC.The results showed that at 6 h T-AOC was induced,and the biggest inducement rate of SOD,CAT and GST activities were 111.26%and 55.47%,72.79%and 61.61%,33.35%and 52.76%in the two bacteria,respectively.At 24 h SOD and CAT inA.lwoffiiDNS32 were induced,and GST and T-AOC were inhibited.But SOD,CAT,GST activities and T-AOC inS.aureusR2 were inhibited at 24 h.Compared withS. aureusR2,A. lwoffiiDNS32 had relatively high tolerance to atrazine stress.
atrazine;atrazine-degrading bacteria;antioxidant enzymes;reactive oxygen species(ROS)
X172
A
1005-9369(2014)01-0065-06
2012-02-25
國家“十二五”科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD04B02)
張穎(1972-),女,教授,博士,博士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)榄h(huán)境污染生物修復(fù)。E-mail:zhangyinghr@hotmail.com
時(shí)間2014-1-9 19:31:14[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140109.1931.002.html
張穎,孟冬芳,王志剛,等.Acinetobacter lwoffiiDNS32對阿特拉津污染的氧化應(yīng)激響應(yīng)[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(1): 65-69.
Zhang Ying,Meng Dongfang,Wang Zhigang,et al.Oxidative stress response ofAcinetobacter lwoffiiDNS32 exposed to atrazine-contaminated[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(1):65-69.(in Chinese with English abstract)
東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)2014年1期