劉卓琦 楊曉紅 肖影群 黃 波 章 萍 楊仙荷黃 昀 王煒東 王蒙蒙 羅達亞＊

（1南昌大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，江西南昌330006；2南昌大學附屬感染病醫(yī)院病理科，江西南昌330002；3南昌大學第二臨床醫(yī)學院2011級，江西南昌330006）

MicroRNA（miRNA，miR）是廣泛存在于生物個體的一類非蛋白編碼小分子RNA。作為動植物體內(nèi)的重要調(diào)控分子，miRNAs與細胞的基因表達、個體發(fā)育、組織分化等一系列生理、病理過程密切相［1，2］關。

因能進行定性、半定量及定位分析，在異質(zhì)性明顯的組織標本中，miRNA 原位雜交（miRNA in－situ hybridization，MISH）技術(shù)不僅具有較其他常規(guī)miRNA分析方法操作簡便、費用低廉等優(yōu)點，同時，由于miRNA具有不易降解而在石蠟包埋組織中長期穩(wěn)定存在的特性，使得MISH技術(shù)在臨床科研中的應用受到越來越多的關注［3，4］。然而，常規(guī)MISH操作仍然受到多重因素的影響，包括臨床標本的組織來源、保存時間；組織切片的厚度；蛋白酶K的濃度、孵育時間；探針的濃度、孵育時間、特異性；顯色方式等。為此，對影響MISH技術(shù)操作的諸多因素進行實驗探討，有助于該方法的建立、完善并在科研工作中廣泛應用。

材料和方法

1．材料

原位雜交實驗中的石蠟組織均來源于南昌大學附屬感染病醫(yī)院病理科。所有石蠟組織均常規(guī)4%中性甲醛固定、石蠟包埋，經(jīng)HE染色證實其病理類型。

2．試劑

U6和miR－375地高辛標記探針及其相關原位雜交檢測試劑購自丹麥Exiqon公司，原位雜交封閉液與洗滌液購自美國Roche公司；Trizol RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；miRNA逆轉(zhuǎn)錄與PCR引物購自廣州市銳博生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit）購自美國Thermo公司；實時定量PCR試劑盒（SYBR?Premix Ex TaqTM）購自日本Takara公司。

3．原位雜交

原位雜交使用的液體試劑均需用0．1%DEPC水配制。組織切片原位雜交步驟如下：石蠟包埋組織切片后脫蠟，于37℃蛋白酶K消化15min，漂洗后梯度乙醇脫水。55℃恒溫預雜交1h后，地高辛標記的miRNA探針55℃恒溫雜交1h。堿性磷酸酶標記的羊抗地高辛抗體室溫孵育1h，NBT／BCIP暗處30℃顯色。爬片細胞原位雜交步驟如下：培養(yǎng)后的爬片細胞用37℃預溫PBS漂洗三次后，4%中性甲醛固定5min。蛋白酶K消化與雜交過程與組織切片一致。NBT／BCIP暗處30℃顯色后伊紅復染顯示細胞基本形態(tài)。雜交過程選擇U6探針以及用未添加探針的雜交液處理的組織、細胞作為陰性對照。結(jié)果判定：U6呈藍色或藍紫色顆粒的陽性信號定位于細胞的胞核；miR－375呈藍色或藍紫色顆粒的陽性信號定位于細胞胞質(zhì)和核仁。

4．細胞培養(yǎng)

三株人乳腺癌細胞株BT549、T47D和MDAMB－231均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫，三株細胞均選擇含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

5．RNA提取、miRNA逆轉(zhuǎn)錄與實時定量PCR

RNA提取按照Trizol試劑盒說明書進行。逆轉(zhuǎn)錄按照 RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit說明書進行。按照 SYBR? Premix Ex TaqTM的操作說明，以U6為內(nèi)參照，使用ABI 7500 Fast Real－Time PCR System（Applied Biosystems，美國）進行實時定量PCR擴增反應，每個樣品3個重復孔。采用公式2－ΔCt（ΔCt＝ Ct miR－375 – Ct U6）計算miR－375的相對表達量。

結(jié) 果

1．不同保存時間和組織來源的石蠟切片U6探針的原位雜交

選擇1990－2013年不同時間保存的多個乳腺、肺臟、肝臟組織，分別以未添加探針、添加U6探針的雜交液行原位雜交。結(jié)果顯示：來源于不同時間保存的三種組織均有U6顯色，保存時間越短的組織顯色效果越好。其中乳腺組織切片75593與肝臟組織切片5060的U6表達最高，顯色最好。以乳腺組織切片75593為例，陰性對照的乳腺腺上皮胞核顯紅色；U6探針雜交結(jié)果為乳腺腺上皮胞核顯藍紫色（圖1）。

2．不同厚度組織切片的U6探針的原位雜交

選擇U6表達最高的乳腺組織切片75593與肝臟組織切片5060的4μm和6μm切片分別進行原位雜交分析。實驗結(jié)果顯示：組織標本切片越薄，雜交過程中越不易掉片，4μm和6μm厚度的組織切片原位雜交染色未見明顯差異（圖2）。

3．不同濃度的蛋白酶K對組織切片U6探針原位雜交的影響

分別選擇2、20和200μg／ml的蛋白酶K，在37℃孵育乳腺組織切片75593與肝臟組織切片5060后，行U6探針的原位雜交。結(jié)果顯示，在乳腺組織切片75593中，20μg／ml的蛋白酶K作用組較其他組的原位雜交顯色更深，效果最好；在肝臟組織切片5060中，200μg／ml的蛋白酶K作用組的顯色最佳（圖3）。

4．不同濃度的蛋白酶K對爬片細胞的U6探針原位雜交的影響

分別選擇2、20和200μg／ml的蛋白酶K，對乳腺癌MDA－MB－231爬片細胞行U6探針原位雜交。結(jié)果顯示，20μg／ml與200μg／ml濃度的蛋白酶K，于37℃孵育爬片細胞15min后，大部分細胞均因消化過度而喪失細胞基本形態(tài)并脫落；在2μg／ml濃度的蛋白酶K作用后，細胞能保持基本形態(tài)并呈現(xiàn)細胞核內(nèi)特異性藍紫色顯色（圖4）。

5．爬片乳腺癌細胞的miR－375探針原位雜交

選擇BT－549和T47D兩株乳腺癌的爬片細胞行miR－375探針原位雜交檢測，結(jié)果顯示，miR－375主要表達在細胞質(zhì)與核仁，BT－549的miR－375表達明顯低于T47D（圖5）。

6．實時定量RT－PCR分析乳腺癌細胞的miR－375表達

實時定量RT－PCR對BT－549和T47D兩株乳腺癌細胞miR－205表達分析，結(jié)果顯示，BT－549的miR－375表達明顯低于T47D（圖6）。

圖6 實時定量RT－PCR分析BT549和T47D乳腺癌細胞的miR－375表達Fig．6Quantitative real－time RT－PCR analysis for miR－375in BT549and T47Dbreast cancer cells

討 論

定性或定量檢測miRNAs表達的分析方法多種多樣，從原理上主要分為兩大類：基于探針雜交和基于擴增技術(shù)的檢測方法。Northern blotting是基于探針雜交分析中的經(jīng)典方法，也是miRNA檢測的金標準［5］。然而，盡管經(jīng)過多次改良，該方法仍無法避免樣本需求量大、耗時長、操作繁瑣等缺點［6，7］。基于擴增技術(shù)的方法中，實時定量PCR法是現(xiàn)階段使用最為普遍的方法。這種方法的特異性和靈敏性都很高［8］，但與其他基于擴增技術(shù)的檢測方法一樣，該方法存在因PCR擴增后失真miRNA的真實表達信息的缺陷。近年來，miRNA分析中，高通量微陣列芯片（Microarray）和第二代測序技術(shù)獲得了更多的關注［9－12］。然而，由于高通量檢測的成本較高［13］，且由于常規(guī)實驗室生物信息學數(shù)據(jù)分析能力的欠缺，兩種方法的全面普及尚需時日。由于miRNA在石蠟組織標本中不容易被降解而長期穩(wěn)定存在，在臨床標本的分析中，利用石蠟組織標本進行MISH分析越來越多地受到科研人員的青睞。為此，通過探索MISH技術(shù)的各種影響因素，建立并完善具備定性、半定量以及定位信息的MISH方法，對臨床組織標本進行分析將為miRNA的研究帶來更多的便利。

考慮到影響實驗操作的各變量因素之間相互關聯(lián)（如探針的濃度影響探針的孵育時間）以及實驗便利、節(jié)約等原則，在初步建立MISH方法后，通過固定操作中的部分次要變量因素（蛋白酶K的孵育時間15min、探針的孵育時間1h、顯色方式NBT／BCIP），對其他主要變量因素進行了實驗探討。

臨床組織標本是miRNA與人類疾病關聯(lián)研究中的重要資源。現(xiàn)階段，醫(yī)院病理科保存標本多為4%中性甲醛固定的石蠟包埋標本，常規(guī)HE染色切片多為5μm厚度切片。為確認MISH方法是否適用于常規(guī)切片標本的分析，本文選擇不同保存時間段的乳腺、肺臟、肝臟的組織，以未添加探針和添加U6探針的雜交液處理的組織切片作為陰性對照和陽性對照進行U6探針的原位雜交分析。結(jié)果顯示：1）來源于三種組織的多個標本均有胞核內(nèi)U6顯色，但因U6的表達與分布并不均衡，在不同標本來源的切片中顯色程度存在差異；2）來源于1990－2013年保存的石蠟組織標本均能顯色，保存時間越短的組織顯色效果越好；3）4－6μm厚度的組織切片原位雜交染色未見明顯差異。以上結(jié)果表明，由于miRNA分子短小，不容易降解，原位雜交操作完全能在常規(guī)固定并長期保存的多種組織來源的石蠟標本上操作。

原位雜交操作中最主要的兩個變量因素是蛋白酶K與探針的濃度。原位雜交中蛋白酶K的作用是通過部分消化細胞膜和細胞核膜，暴露核酸分子，使得探針能順利地與胞質(zhì)、胞核內(nèi)的核酸分子結(jié)合。蛋白酶K最適濃度的選擇主要與標本的來源、固定時間以及蛋白酶K的孵育時間有密切的關系。如果消化作用不到位，雜交信號將會減弱；消化作用過度，輕則使得雜交信號因彌散而減弱，重則會造成組織的脫片［14－16］。為此，在此次實驗中，分別選擇2、20和200μg／ml的蛋白酶K與U6顯色最強的乳腺組織切片75593、肝臟組織切片5060以及MDA－MB－231爬片細胞孵育15min后，行U6探針的原位雜交。結(jié)果顯示，在乳腺組織切片75593中，20μg／ml的蛋白酶K作用組較其他組的原位雜交顯色更深，效果最好；在肝臟組織切片5060中，200μg／ml的蛋白酶K作用組的顯色最佳。爬片細胞原位雜交實驗中，20μg／ml與200μg／ml濃度的蛋白酶K作用組中，大部分細胞均因消化過度而喪失細胞基本形態(tài)并脫落；2μg／ml濃度的蛋白酶K作用組中，細胞能保持基本形態(tài)并呈現(xiàn)特異性藍紫色顯色。原位雜交中探針濃度的選擇主要與探針的長度、標記方式、孵育時間、靶核酸分子的胞內(nèi)豐度等因素有關。探針濃度過低可能造成雜交信號減弱，探針濃度過高則造成不必要的浪費［17，18］。為此，在探針合成公司推薦的探針使用濃度范圍內(nèi)，此次實驗分別選擇了低、中、高三個濃度進行了摸索，發(fā)現(xiàn)U6與miR－375的原位雜交最適濃度分別為1ng／ml和100ng／ml。以上結(jié)果說明，原位雜交中主要變量因素的選擇受多種因素的影響，依據(jù)標本的組織或細胞來源、標本的固定時間，并參照操作說明分組預實驗以確定主要變量因素是非常必要的。

現(xiàn)有研究表明，使用實時定量RT－PCR對組織的miRNA分析結(jié)果常常與原位雜交分析結(jié)果并不一致［19－24］。造成這種情況的原因，一方面可能是諸如標本來源不同、標本容量較小以及組織標本異質(zhì)性等因素；另一方面，實時定量RT－PCR過程中的引物，尤其是原位雜交探針的特異性常常被忽略了?？紤]到組織的異質(zhì)性可能造成原位雜交與實時定量RT－PCR的結(jié)果存在差異，為驗證探針的特異性，在異質(zhì)性較小的細胞水平上進行操作更為可靠。本次實驗中，選擇了2株乳腺癌細胞分別進行miR－375的實時定量RT－PCR和爬片細胞原位雜交分析。結(jié)果顯示，兩種分析方法均發(fā)現(xiàn)BT－549的miR－375表達明顯低于T47D，間接說明miR－375探針的特異性。為此，在細胞水平上，結(jié)合實時定量RT－PCR的檢測，對雜交探針的特異性進行實驗驗證是非常必要的。這為后續(xù)使用該探針在組織與細胞水平上的原位雜交分析提供了保障。

綜上所述，通過前期實驗確定各種變量因素而建立并完善的MISH技術(shù)，為闡明miRNA的作用機制提供了更為便利的條件。

圖 版 說 明

圖1 正常乳腺上皮U6探針原位雜交結(jié)果（NBT／BCIP顯色，核固紅復染），1A為陽性，1B為陰性對照

圖2 不同厚度的組織切片U6探針原位雜交結(jié)果（NBT／BCIP顯色，核固紅復染），2A為4μm，2B為6μm

圖3 肝臟組織5060在不同濃度蛋白酶K作用后的U6原位雜交（NBT／BCIP顯色，無復染），3A 為20μg／ml，3B為200μg／ml

圖4 2μg／ml蛋白酶K作用 MDA－MB－231乳腺癌爬片細胞的U6探針原位雜交（NBT／BCIP顯色，伊紅復染），4A為×100，4B為×200

圖5 BT549和T47D乳腺癌爬片細胞miR－375探針原位雜交（×100，NBT／BCIP 顯 色，核 固 紅 復 染），5A 為BT549，5B為 T47D

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1In situ hybridization analysis for negative（1A），U6（1B）in breast tissue 75593slices（NBT／BCIP solution，Nuclear Fast Red counterstaining）

Fig．2In situ hybridization analysis for U6in breast tissue 75593slices of different slice thickness （NBT／BCIP solution，Nuclear Fast Red counterstaining）．2A：4 μm，2B：6μm

Fig．3In situ hybridization analysis for U6in different concentration proteinase K treated liver tissue 5060slices（×100，NBT／BCIP solution，without counterstaining）．3A：20μg／ml，3B：200μg／ml

Fig．4In situ hybridization analysis for U6in 2μg／ml proteinase K treated MDA－MB－231breast cancer cell’s climbing slices （NBT／BCIP solution，Eosin counterstaining）．4A：×100，4B：×200

Fig．5In situ hybridization analysis for miR－375in BT549（5A）and T47D（5B）breast cancer cells’climbing slices（×100，NBT／BCIP solution，Nuclear Fast Red counterstaining）

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