王永威，廖祥儒，黎循航，蔡宇杰

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

響應(yīng)面法優(yōu)化鐮刀霉菌JN158產(chǎn)色素培養(yǎng)基

王永威，廖祥儒，黎循航，蔡宇杰*

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）對(duì)鐮刀霉菌JN158產(chǎn)色素的發(fā)酵培養(yǎng)基7種營養(yǎng)物質(zhì)配比進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：蔗糖、花生餅粉和FeSO4·7H2O的添加量顯著影響色素產(chǎn)量；用最陡爬坡試驗(yàn)使這3個(gè)顯著因素的添加量接近最大響應(yīng)區(qū)域，優(yōu)化后，鐮刀霉菌產(chǎn)色素的培養(yǎng)基添加量分別為：蔗糖30.18 g/L、花生餅粉4.86 g/L、K2HPO4·3H2O 1 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、CaCl20.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.0122 g/L，預(yù)測的最大色素產(chǎn)量是1.268 g/L，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到的色素產(chǎn)量為（1.252±0.011）g/L，與預(yù)測值相近，優(yōu)化后色素的產(chǎn)量是以前的2.9倍。

鐮刀霉菌；色素；Plackett-Burman設(shè)計(jì)；響應(yīng)面；培養(yǎng)基

色素在人們的生活中起著重要的作用。色素可以改善食品的顏色，是決定產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一，同時(shí)，有的色素還具有營養(yǎng)保健和抗腫瘤的作用[1-6]。色素一般分為天熱素色和合成色素。天然色素主要來源于植物、動(dòng)物和微生物等，一般具有營養(yǎng)保健功能，合成色素雖然有很多優(yōu)點(diǎn)，但是合成色素一般有毒性和致癌性[7-8]，因此，合成色素逐漸被天然色素取代。微生物色素是天然色素的重要發(fā)展方向，微生物色素不僅可以一年四季連續(xù)不斷的發(fā)酵生產(chǎn)，能滿足日益增加的社會(huì)需求，而且大部分微生物色素具有活性和醫(yī)療作用[9-11]。

有許多文獻(xiàn)報(bào)道真菌在抗腫瘤方面的研究[12]，報(bào)道做多的是真菌多糖，常見的是冬蟲夏草多糖[13]和靈芝多糖[14]，關(guān)于鐮刀霉菌色素抗腫瘤的研究很少。本實(shí)驗(yàn)室篩選到一株產(chǎn)色素的鐮刀霉菌（Fusarium sp.）JN158，初步研究表明，該菌株產(chǎn)生的色素具有抗腫瘤[15]作用，且該色素的溶解性質(zhì)也很少見，因?yàn)橹荒苋芙庥谒嵝缘挠袡C(jī)溶劑中，極有可能有是一種新的色素結(jié)構(gòu)，但是，該菌株的色素產(chǎn)量特別低，因此，有必要對(duì)該菌株進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，提高色素產(chǎn)量，為色素的結(jié)構(gòu)鑒定和抗腫瘤[15]作用研究提供足量的樣品。

響應(yīng)面優(yōu)化法試驗(yàn)次數(shù)少、周期短、回歸方程精度高[15]，可研究因素之間的交互作用。本實(shí)驗(yàn)首先用Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出對(duì)色素產(chǎn)量有顯著影響作用的因素[14]，然后用最陡爬坡試驗(yàn)逼近最大響應(yīng)區(qū)域，最后進(jìn)行響應(yīng)面的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析，得出最佳培養(yǎng)基成分配比，可為后續(xù)有關(guān)此色素的結(jié)構(gòu)鑒定與抗腫瘤方面的實(shí)驗(yàn)奠定產(chǎn)量基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種

鐮刀霉菌Fusarium sp. JN158菌株 江南大學(xué)生物工程學(xué)院篩選并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA種子斜面培養(yǎng)基（g/L）：土豆200、葡萄糖20、瓊脂20，pH值自然。種子培養(yǎng)基（g/L）：土豆200、葡萄糖20，pH值自然。液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖40、花生餅粉4、K2HPO4·3H2O 0.5、NaCl 0.5、CaCl20.5、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.01，pH值自然。

1.1.3 試劑與儀器

高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；ALC-210.3電子天平 德國賽多利斯公司；PB-10 pH計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；EZ585Q冷凍干燥機(jī) 美國FTS公司；Agilent1200液相色譜儀 美國安捷倫公司；722分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠；DHG-9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

在超凈臺(tái)內(nèi)，從種子斜面上挑取一環(huán)菌落轉(zhuǎn)移至裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，于30℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)28 h，至種子液OD560nm值為3.0。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)

按6%的接種量移取鐮刀霉菌種子液（OD560nm值為3.0）至裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，在200 r/min、30℃條件下的搖床中培養(yǎng)3d，獲得色素發(fā)酵液。

1.2.3 色素提取

色素發(fā)酵液于8 000 r/min、4℃條件下的冷凍離心機(jī)中離心，去除上清液，用蒸餾水洗滌菌體后再次離心，重復(fù)3次，得紫色色素菌體；色素菌體在60℃的烘箱中烘干至恒質(zhì)量，得干菌體；干菌體放于裝有50 mL用鹽酸調(diào)至pH 1的無水乙醇的250 mL三角瓶中，在200 r/min、30℃的搖床中浸提10 h，然后，8 000 r/min、4℃冷凍離心，得到紅色色素提取液，用1mol/L的NaOH溶液中和色素浸提液至pH7，此時(shí)，色素沉淀，再次冷凍離心，得到藍(lán)色色素粗品，色素樣品在510nm波長處有最大吸收[15]。

1.2.4 Plackett-Burman設(shè)計(jì)

用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)[16-19]，對(duì)色素液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的7種營養(yǎng)成分進(jìn)行篩選：蔗糖、花生餅粉、K2HPO4·3H2O、NaCl、MgSO4·7H2O、CaCl2、FeSO4·7H2O，每個(gè)變量分別取高（+）和低（—）兩個(gè)水平，以中心點(diǎn)添加量的1/4為Plackett-Burman設(shè)計(jì)步長，即高水平添加量為中心點(diǎn)添加量的1.25倍，中心點(diǎn)的添加量是低水平添加量的1.25倍，中心點(diǎn)試驗(yàn)3次，共15組試驗(yàn)，每組3次平行，忽略各因素之間的交互作用，設(shè)計(jì)結(jié)果見表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Factors and levels for Plackett-Burman design

1.2.5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)

由Plackett-Burman試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果可知，蔗糖、花生餅粉和FeSO4·7H2O對(duì)色素產(chǎn)量有顯著影響，以其試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)擬合得模型方程為依據(jù)，遵循最陡爬坡試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)試驗(yàn)[20]，設(shè)計(jì)結(jié)果見表2。

表2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Factors and levels for steepest ascent design

1.2.6 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（central composition design，CCD）

以尋找到的中心點(diǎn)為出發(fā)點(diǎn)進(jìn)行CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)[21]，每個(gè)因素取3個(gè)水平。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析得到一個(gè)二次多項(xiàng)式方程，此方程反映了響應(yīng)量與自變量的關(guān)系，由此可以找出響應(yīng)面最高點(diǎn)，就是最佳的培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的含量。中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及水平取值見表3。

表3 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平及編碼Table 3 Factor and levels for central composite design

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果與分析

通過Plackett-Burman試驗(yàn)，篩選出對(duì)鐮刀霉菌JN158液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素有顯著影響作用的營養(yǎng)成分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，方差及回歸分析分別見表5和表6。

由表5方差分析可知，該模型在95%概率水平下是顯著的（P＜0.05），失擬合也顯著（P＜0.05）；由表6回歸分析的結(jié)果可知，對(duì)于色素的合成，X1、X2和X7在95%概率水平上有顯著影響，即蔗糖、花生餅粉和FeSO4·7H2O的添加量，其中，蔗糖表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)，花生餅粉和FeSO4·7H2O表現(xiàn)為正效應(yīng)，其余各因素均為不顯著。利用Design-Expert8.0軟件對(duì)色素產(chǎn)量回歸分析得一元回歸方程：

此模型P=0.0216＜0.05，說明回歸方程顯著；模型的決定系數(shù)：R2=0.908，表明90%實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的變化可用該模型解釋。

表4 Plackett-Burman設(shè)計(jì)及結(jié)果分析Table 4 Experimental design and results of the Plackett-Burman design

表5 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Analysis of variance for the results of Plackett-Burman experimental design sign

表6 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)色素產(chǎn)量回歸分析Table 6 Regression analysis for pigment production based on Plackett-Burman experimental design

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果與分析

由模型方程（1）和回歸分析的結(jié)果可以確定最陡爬坡路徑。對(duì)于色素的產(chǎn)量，K2HPO4·3H2O（X3）、MgSO4·7H2O（X4）、NaCl（X5）、CaCl2（X6）在95%概率水平上差異不顯著，故添加量不變。蔗糖（X1）、花生餅粉（X2）、FeSO4·7H2O（X7）在95%概率水平上差異顯著，改變?nèi)叩奶砑恿繉?duì)色素的產(chǎn)量的變化有著重要的影響。

表2列出了蔗糖、花生餅粉和FeSO4·7H2O的改變方向及變化步長。由表7可知，試驗(yàn)4組對(duì)應(yīng)的色素產(chǎn)量最高，達(dá)到1.023 g/L。所以，以試驗(yàn)4組所對(duì)應(yīng)的蔗糖、花生餅粉和FeSO4·7H2O的添加量為出發(fā)點(diǎn)進(jìn)行后面響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，即蔗糖28 g/L、花生餅粉4.75 g/L、FeSO4·7H2O 0.0121 g/L。

表7 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 Experimental design and results of steepest ascent

2.3 中心組合試驗(yàn)結(jié)果與分析

以最陡爬坡試驗(yàn)得到的中心點(diǎn)為基點(diǎn)，進(jìn)行色素產(chǎn)量優(yōu)化的中心組合設(shè)計(jì)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表8。

表8 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 8 Experimental design and results of CCD

利用Design-Expert8.0軟件對(duì)CCD的試驗(yàn)數(shù)據(jù)回歸擬合得二次多項(xiàng)式方程：

由表9方差分析及表10回歸分析結(jié)果可知，此模型在99%概率水平下是顯著的（P＜0.05），失擬合顯著（P＜0.05），表明該模型不需要添加更多的因素；另外，此模型的決定系數(shù)R2=0.9707，則此模型可解釋97%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)變化，R2adj=0.9179，與0.9707相近，為色素發(fā)酵提供一個(gè)合適的方程模型。

表9 中心組合設(shè)計(jì)方差分析Table 9 Analysis of variance for the experimental results of CCD

表10 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸分析結(jié)果Table 10 Regression analysis for pigment production based on CCD

由圖1響應(yīng)面可知，蔗糖、花生餅粉和FeSO4·3H2O這三者之間相互有交互作用，對(duì)該回歸方程求導(dǎo)得到此模型的最大值，X1=0.545，X2=0.439，X3=0.098，對(duì)應(yīng)蔗糖、花生餅粉和FeSO4·7H2O的添加量分別為30.18、4.86g/L和0.0122g/L，最大響應(yīng)值為1.268g/L。優(yōu)化后的培養(yǎng)基：蔗糖30.18g/L、花生餅粉4.86g/L、K2HPO4·3H2O 1g/L、NaCl 0.5g/L、MgSO4·3H2O 0.5 g/L、CaCl20.5 g/L、FeSO4·3H2O 0.0122 g/L。為驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果，在此條件下進(jìn)行色素發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，得色素產(chǎn)量為（1.252±0.011）g/L，預(yù)測值和實(shí)際值相近，說明擬合性較好，菌株優(yōu)化后的色素產(chǎn)量是優(yōu)化前（0.432 g/L）的2.9倍。

圖1 蔗糖、花生餅粉與FeeSSOO4·77HH2O的交互作用影響色素產(chǎn)量的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots showing the effects of sucrose, peanut meal and FeSO4·7H2O on pigment production

3 結(jié) 論

用Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出了對(duì)鐮刀霉菌產(chǎn)色素有顯著影響作用的3個(gè)因素：蔗糖、花生餅粉、FeSO4·7H2O；由最陡爬坡試驗(yàn)找到接近最大相應(yīng)區(qū)域的一點(diǎn)：蔗糖28 g/L、花生餅粉4.75 g/L、FeSO4·7H2O 0.0121 g/L；由響應(yīng)面試驗(yàn)得出最佳培養(yǎng)及配比：蔗糖30.18 g/L、花生餅粉4.86 g/L、K2HPO4·3H2O 1g/L、NaCl 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、CaCl20.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.0122 g/L，預(yù)測的最大色素產(chǎn)量是1.268 g/L，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到的色素產(chǎn)量為（1.252±0.011）g/L，與預(yù)測值相近，優(yōu)化后色素的產(chǎn)量是原來的2.9倍，初步研究表明，色素有抗氧化活性和抗癌[12]作用。因此，色素產(chǎn)量的提高，為下一步的色素結(jié)構(gòu)鑒定和抗癌作用方面研究提供足量的色素樣品。

[1] 陳運(yùn)中. 天然色素的生產(chǎn)及應(yīng)用[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 2007: 21.

[2] 鄧祥元, 王淑軍, 李富超. 天然色素的資源和應(yīng)用[J]. 中國調(diào)味品, 2006, 10(10): 49-53.

[3] 王薇. 食用天然色素的營養(yǎng)保健作用[J]. 中國食物與營養(yǎng), 2005(1): 45-47.

[4] 張慶杰, 丁霄霖. 番茄紅素的保健作用與開發(fā)[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 1997, 23(4): 72-75.

[5] SAVA V M, YANG S M, HONG M Y, et a1. Isolation and characterization of melanic pigments derived from tea and tea polyphenols[J]. Food Chemistry, 2001, 73(2): 177-184.

[6] 汪秋安, 聶全文. 具有生理功能的天然色素: 類胡蘿卜素[J]. 北京日化, 1999, 1(1): 16-21.

[7] 于立青, 彭蜀晉. 食品色素和人體健康[J]. 化學(xué)教育, 2005, 6(1): 3-5.

[8] 潘淮. 健康的美麗殺手: 合成色素[J]. 廣州食品工業(yè)科技, 2003, 19(1): 53-54.

[9] BUTLER M J, DAY A W. Fungal melanins: a review[J]. Canadian Journal of Microbiology, 1998, 44(9): 1115-1136.

[10] 王君, 張寶善. 微生物生產(chǎn)天然色素的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2007, 34(3): 580-583.

[11] ZHANG Hechun, CHEN Liang, JI Wenming, et a1. Identifi cation of a blue-pigment producing Streptomyces and the properties of blue pigment[J]. Journal of Wuxi University of Light Industry, 1999, 18(3): 23-28.

[12] 陸一. 抗腫瘤真菌藥物的研究進(jìn)展[J]. 中國藥業(yè), 2007, 16(11): 64-66.

[13] 趙躍然, 王美嶺, 徐貝力. 冬蟲夏草多糖對(duì)小鼠抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 1992, 12(4): 52-53.

[14] 逯海燕, 郭順星, 林晨. 真菌多糖等代謝產(chǎn)物的抗腫瘤藥理研究綜述[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2000, 12(6): 74-77.

[15] 李昌偉. Fusarium sp.jn158液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紫色素的提取及分離純化和特性研究[D]. 無錫: 江南大學(xué), 2012.

[16] SUMEYRA G. Optimization of culture conditions for Aspergillus sojae expressing an Aspergillus fumigatus galactosidase[J]. Bioresource Technology, 2011, 102: 4925-4929.

[17] 王維, 師俊玲, 楊保偉. Plackett-Burman設(shè)計(jì)法篩選影響莖點(diǎn)菌屬在液體培養(yǎng)中生產(chǎn)松脂醇二葡萄糖苷的主要影響因子[J]. 食品科技, 2008, 6(2): 16-18.

[18] 李昌偉, 蔡宇杰, 廖祥儒. 鐮刀霉菌(Fusarium sp.)JN158紫色素的提取及理化性質(zhì)[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2011, 30(1): 140-142.

[19] ABDULAZIZ Q M. Application of Plackett-Burman factorial design to improve citrinin production in Monascus ruber batch cultures[J]. Botanical Studies, 2006, 47(4): 167-172.

[20] KRISHNAN S, PRAPULLA S G, RAJALAKSHMI D, et al. Screening and selection of media components for lactic acid production using Plackett-Burman design[J]. Bioprocess Engineering, 1998, 19(4): 61-65.

[21] NADIA A, MAHMOUD M. Polyglutamic acid(PGA) production by Bacillus sp. SAB-26: application of Plackett-Burman experimental design to evaluate culture requirements[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2005, 69(6): 259-267.

Optimization of Medium Composition for Pigment Production by Fusarium sp. JN158 with Response Surface Methodology

WANG Yong-wei, LIAO Xiang-ru, LI Xun-hang, CAI Yu-jie*
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Plackett-Burman design and response surface methodology (RSM) were applied to optimize 7 components in the medium for pigment production by Fusarium sp.JN158. The results showed that the yield of pigment was mainly infl uenced by the concentrations of glucose, peanut meal and FeSO4·7H2O. With central composite design and RSM, the optimal medium composition and concentrations was determined to be sucrose (30.18 g/L), peanut meal (4.86 g/L), K2HPO4·3H2O(1 g/L)，NaCl (0.5 g/L), MgSO4·7H2O (0.5 g/L), CaCl2(0.5 g/L), and FeSO4·7H2O (0.0122 g/L). The experimental yield of pigment produced by Fusarium sp. JN158 in the optimized medium was (1.252±0.011) g/L, which was close to the predicted value of 1.268 g/L.

Fusarium; pigment; Plackett-Burman design; response surface methodology; medium

Q81

A

1002-6630(2014)01-0120-05

10.7506/spkx1002-6630-201401023

2012-10-25

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21045007）；江蘇省科技創(chuàng)新與成果轉(zhuǎn)化（重大科技支撐與自主創(chuàng)新）專項(xiàng)（BY2010117）

王永威（1987—），男，碩士，研究方向?yàn)槊概c色素。E-mail：weiwei20088725@126.com

*通信作者：蔡宇杰（1973—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。E-mail：yu_jie_cai@yahoo.com.cn